En fremgangsmåde til isolation af enkelte retinale celler og efterfølgende amplifikation af de cDNA'er beskrevet. Encellede transcriptomics viser graden af cellulær heterogenitet er til stede i et væv og afdækker nye markørgener for sjældne cellepopulationer. Den ledsagende protokol kan tilpasses mange forskellige celletyper.
Meget specialiserede, men umådelig lille populationer af celler spiller en vigtig rolle i mange væv. Identifikation af celletype-specifikke markører og genekspression programmer for ekstremt sjældne celledelmængder har været en udfordring ved anvendelse af standard hel-væv fremgangsmåder. Genekspression profilering af de enkelte celler giver mulighed for hidtil uset adgang til celletyper, der udgør kun en lille procentdel af den samlede væv 1-7. Desuden kan denne teknik anvendes til at undersøge genekspressionssystemer programmer, der transient udtrykt i små antal celler under dynamiske udviklingsmæssige overgange 8.
Dette problem af cellulær mangfoldighed opstår gentagne gange i centralnervesystemet (CNS), hvor neuronale forbindelser kan forekomme mellem ganske forskellige celler 9. Det nøjagtige antal af distinkte celletyper er ikke nøjagtigt kendt, men det er blevet skønnet, at der kan være så mange som 1000 forskellige typer i cortex itself 10. Funktionen (r) af komplekse neurale kredsløb kan stole på nogle af de sjældne neuronale typer og de gener, de udtrykker. Ved at identificere nye markører og bidrager til molekylært klassificere forskellige neuroner, er det enkelt-celle fremgangsmåde særligt nyttige i undersøgelsen af celletyper i nervesystemet. Det kan også bidrage til at belyse mekanismerne for neural udvikling ved at identificere differentielt udtrykte gener og gen-veje i de tidlige stadier af neuronal stamfader udvikling.
Som en enkel, let tilgængelige væv med stor neuronal mangfoldighed er vertebrat nethinden en fremragende model-system til undersøgelse af processerne i cellulære udvikling neuronal differentiering og neuronal differentiering. Men som i andre dele af CNS, kan det cellulære mangfoldighed udgør et problem for fastlæggelse af de genetiske veje, der driver retinale stamfædre til at vedtage en bestemt celle skæbne, især i betragtning af, at stavfotoreceptorer udgør maHovedparten af den totale retinal cellepopulation 11. Her rapporterer vi en fremgangsmåde til identifikation af transkripter udtrykt i enkelte retinale celler (figur 1). Den encellede profilering teknik muliggør vurderingen af mængden af heterogenitet stede i forskellige cellulære populationer af nethinden 2,4,5,12. Desuden har denne fremgangsmåde vist en række nye kandidatgener som kan spille rollen (er) i celleskæbnen beslutningsprocesser, der forekommer i delmængder af retinale progenitorceller 8. Med nogle enkle justeringer af protokollen, kan denne teknik kan anvendes til mange forskellige væv og celletyper.
Et stadigt voksende antal undersøgelser afsløre robust celle-til-celle variation i populationer, der menes at være mere homogene med hensyn til deres genekspression 6,8. I mindst et tilfælde har denne genekspression "støj" blevet vist at spille en vigtig biologisk funktion 13. Genekspressionssystemer forskelle mellem individuelle celler er dækket ved hjælp af traditionelle hel-væv metoder. Disse eksperimenter generere ekspressionsprofilen af et "gennemsnitligt" celle, so…
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.