En metode for isolering av single netthinnens celler og påfølgende forsterkning av deres cDNAs er beskrevet. Encellede transcriptomics avslører graden av cellulær heterogenitet stede i en vev og avdekker nye markør gener for sjeldne celle populasjoner. Den medfølgende protokollen kan tilpasses mange forskjellige celletyper.
Høyt spesialiserte, men overmåte små populasjoner av celler spiller viktige roller i mange vev. Identifiseringen av celle-type spesifikke markører og genuttrykk programmer for ekstremt sjeldne celle undergrupper har vært en utfordring ved bruk av standard hel-vev tilnærminger. Genuttrykk profilering av individuelle celler gir enestående tilgang til celletyper som utgjør bare en liten prosentandel av det totale vev 1-7. I tillegg kan denne teknikken brukes til å undersøke genekspresjon programmene som er forbigående uttrykt i små antall celler under dynamiske utvikling overganger 8.
Denne utgaven av mobilnettet mangfold oppstår gjentatte ganger i det sentrale nervesystemet (CNS), hvor nevrale forbindelser kan forekomme mellom ganske ulike celler 9. Det nøyaktige antallet distinkte celletyper er ikke nøyaktig kjent, men det har blitt anslått at det kan være så mange som 1000 forskjellige typer i cortex itself 10. Funksjonen (e) av komplekse nevrale kretser kan stole på noen av de sjeldne nevrale typene og hvilke gener de uttrykker. Ved å identifisere nye markører og bidra til å molecularly klassifisere ulike nerveceller, er encellede tilnærming spesielt nyttig i analysen av celletyper i nervesystemet. Det kan også bidra til å belyse mekanismene for nevral utvikling ved å identifisere differensielt uttrykte gener og gen veier under tidlige stadier av nevronale stamceller utvikling.
Som en enkel, lett tilgjengelig vev med betydelig neuronal mangfold, er virveldyr netthinnen en utmerket modellsystem for å studere prosessene i mobilnettet utvikling, neuronal differensiering og nevronale diversifisering. Men som i andre deler av CNS, kan dette mobilnettet mangfoldet presentere et problem for å bestemme de genetiske mekanismer som driver netthinnens stamfedre til å vedta en bestemt celle skjebne, spesielt på grunn av at Rod fotoreseptorene utgjør majority av den totale retinal cellen befolkning 11. Her rapporterer vi en metode for identifisering av vitnemål uttrykt i enkle netthinnens celler (figur 1). Den encellede profilering teknikk åpner for vurdering av mengden av heterogenitet stede innenfor ulike cellulære bestander av netthinnen 2,4,5,12. I tillegg har denne metoden avdekket en rekke nye kandidat gener som kan spille rollen (e) i cellen skjebne beslutningsprosessene som skjer i undergrupper av netthinnens stamceller 8. Med noen enkle justeringer i protokollen, kan denne teknikken brukes til mange forskjellige vev og celletyper.
Et stadig voksende antall studier er avslørende robust celle-til-celle variasjon i populasjoner som ble antatt å være mer homogen med hensyn til deres genuttrykk 6,8. I minst ett tilfelle har dette genet uttrykket "støy" vist seg å spille en viktig biologisk funksjon 13. Genekspresjon forskjeller mellom de enkelte cellene er skjult ved hjelp av tradisjonelle hel-vev metoder. Disse eksperimentene generere uttrykk profilen en "gjennomsnittlig" celle, som kanskje ikke er repre…
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.