En metod för isolering av enskilda retinala celler och efterföljande amplifiering av deras cDNA är beskriven. Encelliga transkriptomik avslöjar graden av cellulär heterogenitet som finns i en vävnad och avslöjar nya markörgener för sällsynta cellpopulationer. Den åtföljande protokollet kan anpassas för att passa många olika celltyper.
Högspecialiserade, men ytterst små populationer av celler spelar en viktig roll i många vävnader. Identifieringen av cell-typspecifika markörer och gener program uttryck för extremt sällsynta cellundergrupper har varit en utmaning med normala hela-vävnad metoder. Gene expression profiling av individuella celler möjliggör oöverträffad tillgång till celltyper som utgör endast en liten andel av den totala vävnaden 1-7. Dessutom kan denna teknik användas för att undersöka de program genuttryck som transient uttrycks i små antal celler under dynamiska utvecklingsmässiga övergångar 8.
Detta nummer av cellulära mångfald uppstår upprepade gånger i det centrala nervsystemet (CNS) där neuronala kopplingar kan förekomma mellan ganska olika celler 9. Det exakta antalet distinkta celltyper är inte exakt känd, men det har uppskattats att det kan finnas så många som 1000 olika typer i hjärnbarken itself 10. Funktionen (s) av komplexa neurala kretsar kan förlita sig på några av de sällsynta neuronala typerna och de gener de uttrycker. Genom att identifiera nya markörer och hjälpa till att molekylärt klassificera olika nervceller, är encelliga strategi särskilt användbart vid analys av celltyper i nervsystemet. Det kan också bidra till att belysa mekanismerna för neural utveckling genom att identifiera differentiellt uttryckta gener och vägar gen under tidiga stadier av neuronala stamceller utveckling.
Som en enkel, lättillgänglig vävnad med stor neuronal mångfald är ryggradsdjuret näthinnan en utmärkt modell för att studera processer för cellulär utveckling, neuronal differentiering och neuronal diversifiering. Men liksom i andra delar av CNS, kan denna cellulära mångfald ett problem för att bestämma de genetiska vägar som driver retinala progenitorceller att anta en specifik cell öde, särskilt med tanke på att stavar utgör maritetsbeslut av den totala retinala cell-populationen 11. Här rapporterar vi en metod för identifiering av transkripten som uttrycks i enkla retinala celler (figur 1). Den encelliga profilering tekniken gör det möjligt att bedöma av mängden heterogenitet finns inom olika cellulära populationer av näthinnan 2,4,5,12. Dessutom har denna metod visat en mängd nya kandidatgener som kan spela roll (er) i cellen öde beslutsprocesser som sker i delmängder av retinala stamceller 8. Med några enkla justeringar av protokollet, kan denna teknik användas för många olika vävnader och celltyper.
En ständigt växande antal studier avslöjar robust cell till cell variation i populationer som ansågs vara mer homogena med avseende på deras genuttryck 6,8. I åtminstone ett fall har detta genuttryck "brus" visat sig spela en viktig biologisk funktion 13. Genuttryck skillnader mellan enskilda celler skyms med traditionella av hela vävnad metoder. Dessa experiment genererar uttryck profilen för en "genomsnittlig" cell, vilket kanske inte är representativa 14. …
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.