G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama yöntemi<sup> +</sup> (GIRK) kanalları açıklanmıştır. Tahlil GIRK kanal aktivitesini ölçmek için membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar kullanır. Bu teknik, hücre serileri bir dizi kullanım için uyarlanabilir.
G-protein bağımlı içeri düzeltici K + (GIRK) kanalları hormonlar ve nörotransmitterler geniş bir yelpazede hücresel mediatörler olarak işlev ve beyin, kalp, iskelet kas ve endokrin doku 1,2 olarak ifade edilir. GIRK kanallar ve plazma zar bağlı, G proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCRs) ila (nörotransmiterler, hormonlar, ilaç vs) ligand bağlama sonra aktive olur. Bu bağlanma sonradan bağlanır ve GIRK kanalı aktive protein G (G i ve G o) uyarılması neden olur. Bir kez GIRK kanal K hareketi + dışarı daha olumsuz olma potansiyeli istirahat membran neden hücrenin sağlar açtı. Sonuç olarak, nöronlarda GIRK kanal aktivasyon spontan aksiyon potansiyeli oluşumu azalır ve eksitatör nörotransmitterlerin salınımını inhibe eder. Kalbinde, GIRK kanal aktivasyonu böylece kalp hızını yavaşlatan pacemaker aktivitesi inhibe eder.
<pclass = "jove_content"> GIRK kanal tedavisi nöropatik ağrı, ilaç bağımlılığı, kardiyak aritmiler ve diğer bozukluklar 3 için yeni terapötik ajanların geliştirilmesi için yeni hedefleri temsil eder. Bununla birlikte, bu kanalların farmakoloji büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Anti-aritmik ajanlar, antipsikotik ilaçlar ve antidepresan ilaç içeren bir dizi GIRK kanalı bloke rağmen, bu inhibisyon seçici değildir ve nispeten yüksek bir ilaç konsantrasyonlarını 3 meydana gelir.Burada, GIRK kanalların yeni modülatörleri belirlenmesi için bir reel-zamanlı tarama deneyi açıklanmaktadır. Bu deneyde, GIRK kanallar ifade nöronal AtT20 hücreleri, bu tür bis-(1,3-dibutylbarbituric asit) gibi zar potansiyeli hassas boyaların flüoresan ile yüklenir trimethine oxonol [4 DiBAC (3)] ya da HLB 021-152 (Şekil 1 ). Boya molekülleri hücreleri (Şekil 1) içine kuvvetli flüoresan aşağıdaki uptake hale gelir. TedaviGPCR ligandlar olan hücrelerin açmak için GIRK kanallar uyarır. Hücresinin neden K + efflux dışarı daha negatif haline zar potansiyeli ve azaltmak için flüoresan sinyali (Şekil 1) neden olur. Böylece, GIRK kanalı yoluyla K + efflux modüle ilaçlar bir floresan plak okuyucu kullanarak test edilebilir. Diğer iyon kanal tarama testleri gibi atomik absorpsiyon spektrofotometresi 4 veya radyotracer analizi 5 aksine, GIRK kanal fluoresan antikor testi, hızlı, gerçek zamanlı ve ucuz bir tarama prosedürü sağlar.
Membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar iyon kanallarını modüle uyuşturucu 9,10 tanımlamak için kullanılmış iken, bu nöronal GIRK kanal ilaç keşfi için uygulama ilk rapordur. Burada sunulan GIRK kanal fluoresan antikor testi ligand kapılı K + kanalları tarama için hızlı, güvenilir ve gerçek zamanlı bir yöntem sağlar. Tahlil, bir eksojen rekombinant GIRK kanalı 11 veya klonal hücre çizgileri (AtT20, PC-12), bir endojen kanalı ifade ifade ölümsüzleştir…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Amerikan Halk Sağlığı Servisi ödül NS-071.530 tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DMEM | CellGro | 10-013 |
Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
96-well plates | Corning | 3603 |
Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.