Odling och tillämpningar av roterande Wall Vessel Bioreaktor Härstammar 3D epitelceller modeller
Summary
En roterande cellkultursystem som tillåter epiteliala celler att växa under fysiologiska betingelser som resulterar i 3-D-cellulär aggregatbildning beskrivs. Aggregaten genererade display<em> In vivo</em>-Liknande egenskaper observeras inte i konventionella kultur modeller och fungera som en mer korrekt organotypisk modellsystem för en mängd vetenskapliga undersökningar.
Abstract
Celler och vävnader i miljö kroppen-upplevelse förhållanden som påverkar deras arkitektur, intercellulära kommunikation och övergripande funktioner. För in vitro-modeller cellodling att exakt efterlikna vävnaden av intresse, är tillväxten miljö kulturen en viktig aspekt att beakta. Vanligen använda konventionella cellodlingssystem utbreder epitelceller på plana tvådimensionella (2-D) ogenomträngliga ytor. Även om mycket har lärt sig från konventionella system för cellodling, många fynd inte reproducerbara i humana kliniska prövningar eller vävnadsdelar vävnad, eventuellt till följd av bristen på ett fysiologiskt relevant mikromiljö.
Här beskriver vi en kultur system som övervinner många av gränserna kultur skick 2-D cellkulturer, genom att använda den innovativa roterande väggen kärl (RWV) bioreaktor teknik. Vi och andra har visat att organotypiska RWV-härledda modeller kan rekapitulera struktue, funktion och autentiska mänskliga reaktioner på yttre stimuli på liknande sätt som mänskliga explantation vävnader 1-6. Den RWV bioreaktor är en suspensionsodling system som möjliggör tillväxt av epitelceller under låga fysiologiska betingelser fluidumskjuvkraft. De bioreaktorer finns i två olika format, en hög del roterande kärl (HARV) eller en långsamt vrida i sidled (STLV) fartyg, där de skiljer sig åt genom sin luftning källa. Epitelceller sättes till bioreaktorn för val i kombination med porösa, kollagen-överdragna mikrobärarkulor (figur 1A). Cellerna utnyttjar de pärlor som en tillväxt byggnadsställning under konstant fritt fall i bioreaktorn (figur 1B). Mikromiljön som tillhandahålls av bioreaktorn tillåter cellerna att bilda tredimensionella (3-D) aggregat uppvisar in vivo-liknande egenskaper ofta inte observeras vid standardtemperatur 2-D odlingsbetingelser (Figur 1D). Dessa egenskaper omfattar tight junctions, MUCoss produktion, apikal / basal orientering, in vivo protein lokalisering, och ytterligare epiteliala cell-typspecifika egenskaper.
Progressionen från ett monolager av epitelceller till en fullt differentierad 3-D aggregat varierar beroende på cell typ 1, 7-13. Periodisk provtagning från bioreaktorn medger övervakning av epitelial aggregatbildning, cellulära markörer differentiering och livsduglighet (figur 1D). Gång cellulär differentiering och aggregatbildning etableras, cellerna skördas från bioreaktorn och liknande analyser utfördes på 2-D-celler kan appliceras på de 3-D aggregat med några överväganden (figur 1E-G). I detta arbete beskriver vi detaljerade stegen av hur kultur 3-D epitelcellsystem aggregat i RWV bioreaktorsystem och en mängd potentiella analyser och analyser som kan utföras med 3-D-aggregat. Dessa analyser innefattar, men är inte begränsade till, strukturella / morphological analys (konfokal, skanning och transmissionselektronmikroskopi), cytokin / kemokin sekretion och signalsystem cell (cytometrisk pärla array och Western blot-analys), genuttrycksanalys (real-time PCR), toxikologisk / drug analys och värd-patogen interaktioner. Utnyttjandet av dessa analyser lägga grunden för mer djupgående och expansiva studier som metabolomik, transkriptomik, proteomik och andra array-baserade applikationer. Vårt mål är att presentera en icke-konventionella medel för odling av humana epitelceller att producera organotypiska 3-D modeller som rekapitulera den mänskliga in vivo vävnad, i en enkel och robust system som ska användas av forskare med olika vetenskapliga intressen.
Protocol
Discussion
Utnyttjande av RWV bioreaktorn tekniken presenteras här kan ge forskare möjlighet att öka sin nuvarande systemet cellkultur till en mer fysiologiskt relevant organotypisk cellodling modell. Den RWV bioreaktor cellodlingssystem tillhandahåller en lågskjuvande mikromiljö som möjliggör cellerna att bilda 3-D cellulära aggregat med in vivo-liknande egenskaper, inklusive tight junctions mucinproduktion och extracellulära processer (dvs. mikrovilli) och cellulär polaritet. Majoriteten av de uppgifter och e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Brooke Hjelm för hennes teknisk expertis och Andrew Larsen för hans proteinanalys. Detta arbete har finansierats delvis av Alternativ Research Development Foundation (MMHK) Grant och NIH NIAID sexuellt överförbara infektioner och utvärtes mikrobicider kooperativa Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi erkänner tacksamt Biology of Reproduction för återanvändning av siffror.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O’Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
