Summary
Un sistema de cultivo celular giratorio que permite a las células epiteliales de crecer bajo condiciones fisiológicas resultantes en 3-D formación de agregados celulares se describe. Los agregados generado pantalla
Abstract
Las células y los tejidos del cuerpo en las condiciones ambientales que influyen en la experiencia de su arquitectura, las comunicaciones intercelulares y funciones generales. Para los modelos in vitro de cultivos celulares para simular con precisión el tejido de interés, el entorno de crecimiento de la cultura es un aspecto crítico a considerar. Comúnmente se utilizan sistemas convencionales de cultivo de células se propagan en las células epiteliales planas superficies impermeables de dos dimensiones (2-D). Aunque mucho se ha aprendido de los sistemas convencionales de cultivo de células, los resultados de muchos que no son reproducibles en los ensayos clínicos humanos o explantes de tejido, potencialmente como resultado de la falta de un microambiente fisiológicamente relevantes.
A continuación, describimos un sistema de cultivo que supera muchas de las fronteras culturales de la condición 2-D de cultivos celulares, utilizando el innovador giro de la pared vascular (RWV) la tecnología de biorreactor. Nosotros y otros han demostrado que organotípicos RWV derivados de los modelos se pueden recapitular estruce, la función y auténticas respuestas humanas a los estímulos externos de manera similar a los tejidos de explantes humanos 1-6. El biorreactor RWV es un sistema de cultivo en suspensión que permite el crecimiento de células epiteliales en condiciones de baja fisiológicos de fluido de corte. Los biorreactores vienen en dos formatos diferentes, un buque de alta aspecto giratorio (HARV) o un buque lento giro lateral (STLV), en el que se diferencian por su fuente de aireación. Las células epiteliales se añaden al biorreactor de elección en combinación con los granos porosos, microportadoras revestidas por colágeno (Figura 1A). Las células utilizan las perlas como un andamio crecimiento durante la caída libre constante en el biorreactor (Figura 1B). El microambiente proporcionado por el biorreactor permite que las células para formar agregados tridimensionales (3-D) muestran in vivo características similares a menudo no se observa bajo estándar 2-D condiciones de cultivo (Figura 1D). Estas características incluyen uniones estrechas, MUCnos de producción, apical / basal de orientación, en la localización de la proteína in vivo, y otros tipo de células epiteliales de las propiedades específicas.
La progresión de una monocapa de células epiteliales a una totalmente diferenciados en 3-D agregada varía según el tipo de célula 1, 7-13. Muestreo periódico del biorreactor permite la monitorización de la formación epitelial agregado, los marcadores de diferenciación celular y la viabilidad (Figura 1D). Una vez que la diferenciación celular y la formación de agregados se ha establecido, las células se recogen desde el biorreactor, y ensayos similares a cabo en 2-D células se pueden aplicar a los agregados en 3-D con algunas consideraciones (Figura 1E-G). En este trabajo se describen los pasos detallados de cómo la cultura en 3-D agregados de células epiteliales en el sistema de biorreactor RWV y una variedad de ensayos y análisis posibles que se pueden ejecutar con los agregados de 3-D. Estos análisis incluyen, pero no se limitan a, estructural / manálisis de orphological (confocal, análisis y microscopía electrónica de transmisión), citocinas / quimiocinas y la secreción de señalización celular (matriz de citometría de cuentas y análisis de Western blot), análisis de expresión génica (PCR en tiempo real), análisis toxicológico / drogas y de las interacciones huésped-patógeno. La utilización de estos ensayos de sentar las bases para estudios más en profundidad y expansiva como la metabolómica, la transcriptómica, la proteómica y otras aplicaciones basadas en matrices. Nuestro objetivo es dar a conocer un medio no-convencionales de cultivo de células epiteliales humanas para producir organotípicos modelos 3-D que recapitula el ser humano en el tejido vivo, en un sistema fácil y robusto para ser utilizado por los investigadores con diversos intereses científicos.
Protocol
Todos los pasos deben realizarse en condiciones BSL-2 en una campana de flujo laminar.
1. Preparación del biorreactor STLV
- Montar el biorreactor STLV según el protocolo del fabricante y realizar protocolo de desintoxicación para asegurar la esterilidad del biorreactor. Cubrir puertos abiertos con tapones luer y llenar el STLV con etanol al 95% durante 24 h.
- Eliminar el etanol y llenar el STLV con agua destilada esterilizada durante 24 h.
- Repita el paso 1.2 con agua destilada estéril solamente.
- Con la herramienta suministrada por el proveedor, afloje todos los tornillos, gorras y complementos del centro de la STLV y autoclave a 110 ° C durante 20 minutos en una bolsa de esterilización.
- Una vez que el STLV se enfría, apriete los tornillos y repita los pasos 1.1-1.4 para mantener la esterilidad y la desintoxicación completa.
- Apriete los tornillos de enfriado el STLV y el tornillo en la pre-esterilizados en un solo sentido llaves de paso a cada puerto.
- Llave de paso abierta mediante la colocación de los botones verticalmente.
- Retirar los émbolos de un 10 ml y 5 ml de cierre luer jeringa y émbolos manga de re-vuelta en envolturas para mantener la esterilidad. Atornille jeringas Desciende en llaves de paso (jeringas Luer-lock de punta se requiere para este paso).
- Añadir Dulbecco salina tamponada con fosfato (DPBS) a la jeringa de 10 ml hasta que la STLV está llena y se empieza a llenar la jeringa de 5 ml.
- Sustituir los émbolos estériles en cada jeringa y eliminar las burbujas residuales que se producen en biorreactor por la alternancia entre la conducción émbolos de las jeringas.
- Deje las jeringas unidas a biorreactor después de eliminar todas las burbujas. Cerrar llaves de paso y conecte el STLV a la plataforma giratoria vertical y girar por un mínimo de 24 horas para vigilar que no haya fugas.
2. Preparación de perlas microportadoras
- Añadir 15 ml DPBS a ~ 250 mg perlas microportadoras cytodex en un tubo cónico de 50 ml y autoclave bajo mismas condiciones que el STLV (1,4).
- Después de enfriar, quitar DPBS, añadir los medios de comunicación dedicadas al cultivo de epitelioal celular de su interés, y tubo de turbulencia para resuspender las microesferas.
- Repita los pasos con los medios de lavar dos veces más. Después del lavado final, se añadirán 15 ml de medio de cultivo cuentas.
3. Siembra de las células epiteliales y perlas en el biorreactor STLV
- Se cultivan las células epiteliales de interés como monocapas en frascos de cultivo de tejidos hasta obtener ≥ Las 1x10 7 células. Retire las células del frasco (trypinsization es decir, EDTA), recuento de células para establecer la concentración celular, y determinar la viabilidad celular por tinción con azul de tripan exclusión 1.
- Para el tubo cónico que contiene perlas preparadas (ver 2.3), añadir la concentración deseada de las células (2x10 5 1x10 7 células epiteliales) 2, 8, dependiendo del tipo de células epiteliales de la intención (fig. 1A). Asegurarse de todas las células se transfieren enjuagando el tubo cónico.
- Retire DPBS y jeringas de la STLV.
- Retire el tapón del puerto de centro y agregar el epitelio cell / suspensión de perlas en el STLV con una pipeta 10 ml serológica. Enjuagar tubo cónico para asegurar que todas las células o perlas se transfieren a la STLV y reemplazar el enchufe centro puerto.
- Quitar émbolos desde unos 5 y 10 ml jeringas y los émbolos de manga de re-vuelta en envolturas para mantener la esterilidad. Atornille las jeringas en los puertos con las llaves de paso abiertas. Llene el STLV con los medios de comunicación, sustituir los émbolos y llaves de paso cercanos.
- Coloque el recién sembradas STLV en una incubadora a 37 ° C durante 30 minutos sin rotación.
- Abrir las llaves de paso, eliminar las burbujas que utilizan pistones, a continuación, llaves de paso cercanos.
- Coloque el STLV en un 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado giratorio incubadora a 20 rpm (Figura 1B). Las culturas deben hacerse girar de forma continua las 24 h, excepto para la toma de muestras, medios de comunicación que cambian, o agregados de cosecha (ver próxima sección).
4. El cultivo, toma de muestras y documentación fotográfica de las Culturas
- Después de un inicial 96-120 h de cultivo de células en el bioreactor, los medios de comunicación de cambio por la inclinación del STLV y permitiendo que las células o los granos a un acuerdo. Retire las jeringas, abrir las dos llaves de paso, y vierta aproximadamente el 75% de los medios de comunicación de puerto lateral (fig. 1C). Basándose en el metabolismo celular de los medios de comunicación, cambiar los medios de comunicación todos los días o cada dos días después de la siembra inicial y período de la cultura 96-120 h.
- Atornille los días 5 y 10 jeringas sin efecto ml de émbolos y seguir el protocolo de realimentación como se describió anteriormente (01.07 a 01.11), luego enrosque la parte posterior cerrada STLV en su lugar en la rotación de la plataforma.
- Controlar el crecimiento y la viabilidad de los agregados de cada 5-7 días después de sembrar en la STLV retirando cuidadosamente una pequeña cantidad de agregados (~ 200 l) desde el puerto centro en dos tubos de 1,5 ml. Para evitar el corte total, para todas las transferencias totales use una punta de pipeta de 1000 l que ha sido cortado ~ 2 cm desde el punto y se esteriliza.
- Reemplazar el tapón del centro, el intercambio de jeringas nuevas, añadir medio fresco a la STLV como se describió anteriormente (1.7 a 1.11), y coloque la parte posterior STLV en elincubadora con rotación (véase la sección 3.8).
- Para el seguimiento de la viabilidad celular, utilizar uno de los dos 1,5 mL agregados tubo alícuotas en el paso 4,3, y eliminar las células a partir de perlas de la misma manera que las células epiteliales son retirados de los matraces de cultivo de tejidos (es decir tripsinización). Vigilar la viabilidad de exclusión del azul tripano tinción 1.
- Para los agregados celulares de imágenes, agregar 0,5-1 ml de los medios de comunicación a la alícuota de 1,5 mL segundo agregado y la transferencia a una pequeña placa de Petri con un corte de 1.000 l punta de la pipeta. Agregados de imagen utilizando un microscopio de luz invertida (Figura 1D).
5. Transferencia de Áridos y Cosecha
- Para algunos modelos de células epiteliales que es necesario transferir los agregados a una HARV desechable para aumentar la aireación cultura 2. Aproximadamente una semana antes de la cosecha para el análisis de los agregados, retire las jeringas y las llaves de paso de la STLV y vierta aproximadamente el 50% de los medios de comunicación de puerto lateral.
- Remove conecte el STLV el centro y con cuidado vierta todo el contenido en un tubo cónico de 50 ml desde el centro del puerto (Figura 1E). Enjuague los STLV dos veces con 5 ml de medio de enjuague y se combinan con el resto de los agregados.
- Continuar con la transferencia de los agregados como se describe en 5,2, pero los agregados de transferencia desde el tubo cónico de 50 ml a la HARV.
- Con cuidado, los agregados de la cosecha de la HARV después de aproximadamente 1 semana o de la STLV (basado en el tipo de célula) como se realizó anteriormente (5,2). Vea a continuación los posibles formatos de ensayo, ensayos y análisis tras la producción total.
6. Análisis del potencial, Aplicaciones y ensayos realizados con áridos
- Agregados de siembra para diversos formatos experimentales. Transferir la cantidad deseada de los agregados del tubo cónico de 50 ml a un tubo de 1,5 ml, 24 y placa, o placas de 96 pocillos utilizando una línea de corte esterilizado 1000 l punta de la pipeta (Figura 1F).
- Lavado y prepaIng agregados para su análisis. Retire los medios de comunicación después de los agregados se han asentado. Dispense DPBS directamente al centro del tubo, o bien para todos los agregados se agitan. Una vez que los agregados se han depositado en el fondo, retire DPBS y repetir tantas veces como sea necesario.
- Agregados de envío para la experimentación fuera de las instalaciones y el análisis. Agregue la cantidad deseada de los agregados a un tubo de 50 ml y lavar los agregados como en el punto 6.2. Llene completamente Tubo de 50 ml con los medios de comunicación, la tapa y parafina alrededor de la tapa para evitar fugas. Firmemente el envío agregados a la ubicación deseada durante la noche a temperatura ambiente.
- Agregados de fijación para microscopía electrónica (Figura 2). Escaneado, transmisión o microscopía inmuno-electrón puede llevarse a cabo mediante la transferencia de 150-300 l agregados a un tubo de 1,5 ml y lavado 3 veces con agregados DPBS (6,2). Añadir 200 l de aplicación específica (SEM, TEM, inmuno-EM, etc) fijador de microscopía electrónica para el período de incubación deseado. Retire arreglar, lavar AggregatES 2 veces con DPBS, y proceder como se indica en Hjelm et al. 2010 para la exploración y la microscopía electrónica de transmisión 2.
- Imagen microscopía de inmunofluorescencia (Figura 3). Transferencia ~ 100 l agregados a un tubo de 1,5 ml y agregados de lavado (6,2). Fijar y los agregados de la etiqueta con el anticuerpo en condiciones similares a las de monocapas, excepto en un tubo de 1,5 ml. Para montar, colocar una gota de medio de montaje en portaobjetos de microscopio, transferir los agregados marcados en la parte superior de los medios de montaje con un corte de 1.000 l punta de la pipeta, cubreobjetos a cabo durante los agregados, el sello cubreobjetos con esmalte de uñas, y se deslizan en seco durante toda la noche 2.
- Medición de la viabilidad celular / proliferación mediante ensayo MTT (Figura 4). Agregados Pasar a un plato y 24 y sustituir a los medios de comunicación con 625 l de fenol medios de comunicación libres de color rojo. Añadir 62,5 l de 5 mg / ml Tiazolil azul tetrazolio (MTT) a cada pocillo y se incuba durante 4 horas a 37 ° C. Añadir 625 l de 100 mg / ml de SDS-0.01M de HCl a cada pocillo y se incuba durante la noche. Leer la absorbancia a 570 nm y obtener la viabilidad celular% usando la ecuación:
- Los estudios toxicológicos. Transferencia de los agregados a 24 y placa y llevar a cabo la exclusión de azul de tripan en ≥ 2 pozos para la viabilidad celular inicial / concentración. Añadir compuesto de ensayo a concentraciones que van a pocillos duplicados. Para la viabilidad celular (Figura 5), lavar los agregados y realizar la exclusión azul de tripano después del tratamiento. Para TC 50 (Figura 5B), tomar la viabilidad celular de los pocillos duplicados para cada concentración con el tiempo y el uso de Reed Muench método para determinar la concentración tóxica del 50% 2, 15.
- Conjunto de citometría de cordón (CBA) o ELISA. Sobrenadantes celulares se pueden tomar después de sembrar las células en cualquier formato experimental del diagrama. Estimular agregados sembradas como con células cultivadas comomonocapas, recoger los sobrenadantes (≥ 120 l), y almacenar a -80 ° C para su análisis por ELISA o CBA (Figura 6).
- Análisis de ARN. De transferencia ≥ 500 l de los agregados al tubo de 1.5 ml y los agregados de lavado con DPBS. Continuar extracción con kit de Qiagen RNAeasy y el protocolo para las células animales, con la homogeneización de lisado con aguja calibre 20. Asegúrese de dejar perlas se depositan en el fondo del tubo, antes de transferir el sobrenadante, y no transfieren perlas vacías a la columna de centrifugación (perlas se obstruirá membrana columna resultante en bajo rendimiento ARN) (Figura 7).
- El análisis de proteínas. Agregados de cosecha bajo los mismos métodos que con monocapas utilizando un tubo de 1,5 ml o mayor formato experimental. Sin embargo, después de la lisis de los agregados, permitir que las perlas se asiente y transferir lisado a un tubo separado antes de ejecutar un gel de proteína u otra forma de análisis de proteínas (Figura 8).
- Infecciónlos estudios. agregados de semillas en el formato deseado experimentales. Utilice por lo menos dos pozos y muestras de células trypsinizing de abalorios para enumerar el número de células y cuantificar la viabilidad celular. Infect agregados con patógeno de interés en la multiplicidad de la infección seleccionada tal como se realizó con células cultivadas como monocapas (Figura 9). Pasos de lavado debe ser realizado como en 6,2.
- La citometría de flujo: agregados de semillas en tubo de 50 ml, los agregados de lavado (6,2), y añadir 2 mM EDTA durante 5-10 minutos a 37 ° C. Añadir los medios de comunicación 5-10 ml a las células y las células pasan a través de un filtro de células. Alícuotas 1x10 6 células en un tubo de polipropileno y las células de lavado en una solución fría de bloqueo (1% de FBS en PBS). Resuspender las células con anticuerpos y se incuba según el fabricante. Lavar las células por centrifugación, resuspender en PBS y las células de transferencia para filtrar tubo para el análisis (Figura 10).
7. Los resultados representativos
Un ejemplo deun agregado diferenciado humano epitelial cultivado en el sistema biorreactor STLV puede verse en la Figura 2. Las imágenes SEM y TEM se obtienen de las células vaginales humanas cultivadas en el STLV durante 39 días, donde micropuentes invaginaciones, vesículas intracelulares secretoras, y microvellosidades en la superficie apical se pueden observar. Nueva demostración in vivo de características similares a las de células epiteliales cultivadas en el biorreactor puede ser observado por microscopía de inmunofluorescencia confocal imágenes (Figura 3) de 3-D células vaginales que expresan mucina (MUC1) y marcadores específicos para las células epiteliales (ESA) y la diferenciación terminal de (involucrina; INV).
Como se muestra, en 3-D agregados mostrar características ultraestructurales similares a los tejidos, sin embargo sus fenotipos más fisiológicamente relevantes también sirven como una excelente plataforma para evaluar la toxicidad de los compuestos. El ensayo MTT, un ensayo comúnmente utilizado para medir la viabilidad celular, el metabolismo o la proliferaciónción, se puede utilizar para medir la toxicidad de varios productos químicos y sus compuestos (Figura 4). Triton X-100, un detergente que destruye las membranas celulares, se utilizó como control positivo para validar el ensayo MTT. Un método adicional para medir la toxicidad después del tratamiento con compuestos de ensayo es exclusión del azul tripano (Figura 5). Después del tratamiento con el nonoxinol-9 (N-9), los agregados vaginales demostró una respuesta similar a la toxicidad de los modelos de explantes cervicales, pero un perfil diferente en comparación con monocapas 2, 16.
Estudios adicionales que demuestran la capacidad de las células epiteliales, que se cultiva en el biorreactor, para funcionar y la señal de manera similar a los tejidos in vivo, se puede observar en la Figura 6. Tras la estimulación con moléculas derivadas de los microbios que son reconocidos por los receptores Toll-like (TLR), los agregados de responder y secretan citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo IL-6 1.Expresión del receptor de progesterona (PR), un receptor que responde a la estimulación hormonal, también puede observarse en las células vaginales, tanto en el ARN y los niveles de proteína (Figura 7 y Figura 8, respectivamente). Los agregados de 3-D no sólo tienen la capacidad de responder a las moléculas de patógenos y de la hormona, pero también son capaces de soportar funcionalmente un virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infección. Una imagen de microscopio confocal de HSV-2 agregados infectadas vaginales 3-D (Figura 9) demuestra la infección. Paralelas 2-D cultivos de células epiteliales vaginales no se muestran como un resultado de la destrucción celular grave causada por la infección por HSV-2. RWV los derivados 3-D agregados también se han utilizado para cuantificar la replicación bacterial y viral a través de las curvas de crecimiento intracelular y análisis en placa, respectivamente 8, 9. Por último, las propiedades físicas y funcionales de las células individuales dentro de los agregados también puede ser cuantificado por citometría de flujo. Para example, se empleó un ensayo de citometría de flujo para medir la expresión de MUC1 en la superficie de las células individuales de la vagina (Figura 10). Agregados dentro de la vagina en 3-D expresa un menor porcentaje de MUC1 (27,7%) en comparación con monocapas (67,2%). El menor porcentaje de MUC1 en la superficie en 3-D agregados en comparación con monocapas puede ser el resultado de la mayoría de MUC1 ser secretada por las células como se observa en el tracto vaginal 17, 18.
Figura 1. Esquema para el cultivo de células epiteliales humanas en RWV y aplicaciones potenciales utilizando RWV derivados de los agregados. A) Las células epiteliales son inicialmente cultivadas como monocapas en un matraz de cultivo de tejidos. Una vez confluentes, las células se retiran de matraz y se combinan con perlas microportadoras en el biorreactor STLV. Barra de escala:. 80 m B) El STLV gira sobre una plataforma para crear un ambiente constante de caída libre de f bajacorte LUID, permitiendo que las células se adhieren y crecen en las cuentas de lo que forman agregados celulares visibles. C) Después de 96 horas, los medios de comunicación en el STLV debe ser cambiado para acomodar para el metabolismo celular. Los medios de comunicación se vierte fuera de un orificio lateral, medio fresco se sustituye por una jeringa de 10 ml adjunto (émbolo eliminado), y émbolos de la jeringa se sustituyen y se utiliza para las burbujas de extrusión. D) Después de ~ 5 días (d) los agregados se empiezan a formar . Los agregados se muestrean cada 7 días y la imagen por microscopía de luz para controlar su progresión en el desarrollo (20 aumentos de 3-D las células del epitelio vaginal). E) Una vez que la formación global en su integridad y la diferenciación celular se ha producido, los agregados se cosechan en el biorreactor y transferidos a un tubo cónico de 50 ml. f) Los agregados se pueden sembrar en un tubo de 1,5 ml o un formato de placa de múltiples pocillos para llevar a cabo el análisis experimental y los ensayos. G) Esquema de pote ntial ensayos y análisis que pueden realizarse en los agregados. Esta lista representativa de los análisis no pretende ser un catálogo exhaustivo de todas las posibles aplicaciones posteriores.
Figura 2. Al examinar las características morfológicas y estructurales de 3-D agregados de células epiteliales mediante microscopía electrónica. (A) Microscopía electrónica de barrido (SEM) de una 3-D humano agregado de células epiteliales de la vagina. Las barras de escala: 200 micras (100x), 100 micras (200x), 50 micras (500x). Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la imagen de un 3-D humano agregado de células epiteliales vaginales con flechas apuntando a (B) vesículas secretoras intracelulares y microvellosidades o (c) "los procesos citoplásmicos". Las barras de escala: 2 micras (modificado de Hjelm et al 2010). 2.
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Figura 3. Microscopía confocal de inmunofluorescencia utilizado para identificar la diferenciación de la unión y los marcadores de proteínas en 3-D agregados de células epiteliales. Las células vaginales en 3-D extraídas de biorreactor después de 32 días, fijos, y se tiñeron con (A) de anticuerpos mucina MUC1, (B) anticuerpo específico para las células epiteliales, la ESA, o (C) y anti-involucrina (INV) anticuerpo que reconoce células epiteliales terminales diferenciadas. Los agregados fueron etiquetados indirectamente con Alexa 488 anticuerpo secundario (verde). Barra de escala: 60 micras (modificado de Hjelm et al 2010). 2.
Figura 4. Ensayo MTT se utiliza para medir la viabilidad celular. Humanos agregados vaginales 3-D se sembraron en una placa de 24 pocillos y se trató con medio solo (sin tratar) o 0,01%, 0,1% o 1,0% Triton X-100 detergente durante 1 hora a 37 ° C. Followin g tratamiento, se retiró el medio y el ensayo MTT se realizó para medir la viabilidad celular. ** Representa p <0,001; de una cola de la t-test de comparación de Triton X-100 células tratadas con el testigo.
Figura 5. La utilización de 3-D agregados de células epiteliales a la toxicidad del compuesto de la pantalla. (A) El nonoxinol-9 (N-9) dependiente de la dosis curva de viabilidad de 24 horas post-tratamiento de 3-D humana modelo de células del epitelio vaginal (línea roja / bares) en comparación con mismo tipo de células cultivadas como monocapas confluentes (línea negro / bares). (B) de N-9 TC 50 niveles de cultivos de células epiteliales vaginales en (A) a 1,5 h, 4 h, 8 h, y 24 h después del tratamiento. * Representa p <0,05; de una cola de la t-test comparando las monocapas de células en 3-D en cada tiempo de exposición. (Modificado de Hjelm et al. 2010) 2.
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Figura 6. Análisis de la producción de citocinas en las células epiteliales en 3-D en respuesta a Toll-like receptor (TLR) estimulación por el agonista. Tres-D las células vaginales humanas fueron estimulados con FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , y CL097 (TLR7 / 8) durante 24 horas y de las citoquinas secretadas fueron medidos por citometría de matriz grano. La IL-6 se muestra como una citocina proinflamatoria producida representante y medido. * Representa p <0,05; de una cola de la t-test comparando muestras estimuladas con PBS grupo. (Modificado de Hjelm et al. 2010) 2.
Figura 7. Seguimiento expresión génica en las células epiteliales en 3-D. Semi-cuantitativo de RT-PCR análisis del receptor de progesterona (PR) expresión en monocapa (ML) o 3-D humanos células epiteliales vaginales. GAPDH se muestra como un control de carga. Los productos de amplificaciónmostrado son un resultado de transcripción de expresión que ocurren después de 30 ciclos de PCR. Flecha dirige a punto bandas PR sólo se producen en la muestra en 3-D.
Figura 8. Análisis de expresión proteica de 3-D las células epiteliales. Western blot de monocapa y 3-D humanos vaginales lisados de células epiteliales de células enteras (30μg) probaron con un anti-receptor de progesterona (PR) de anticuerpos. β-tubulina se utilizó como una sonda para el control de carga.
Figura 9. Tres-D modelo humano de células epiteliales es compatible con una infección viral productiva. Imagen de microscopía confocal de inmunofluorescencia de 3-D humano agregado células del epitelio vaginal infectados con el HSV-2. Las células se infectaron con una MOI de 1,0 durante dos horas, se lava, se fijo 24 h después de la infección (4% PFA), y se tiñeron con un HSV-2 específicos VP5 capsid anticuerpos (verde) y la nuclear DAPI mancha (azul). Barra de escala: 50 m.
Figura 10. Análisis de células individuales en 3-D modelo humano de células epiteliales mediante citometría de flujo. (A) o monocapa (B) 3-D humanos agregados epiteliales vaginales se disociaron con EDTA, marcado con un anticuerpo conjugado con FITC MUC1 (azul), un control de isotipo (verde), o PBS (rojo), y la expresión FITC se cuantificó por citometría de flujo. Los números representan el porcentaje de células teñidas que positivo para anticuerpos mucina que permaneció después de compuerta a cabo la fluorescencia de fondo de las células teñidas isotipo de control. No uniformes picos son el resultado de la multitud de patrones glycosolation y diversos niveles de MUC1 en la superficie de estas células.
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Discussion
La utilización de la tecnología de biorreactores RWV que aquí se presenta puede proporcionar a los investigadores la capacidad para avanzar en su actual sistema de cultivo celular a un fisiológicamente más relevantes del modelo organotípico cultivo celular. El biorreactor RWV célula sistema de cultivo proporciona un microambiente bajo cizallamiento que permite a las células para formar agregados celulares en 3-D in vivo con características similares, incluyendo uniones estrechas, la producción de mucina, procesos extracelulares (es decir, microvellosidades) y polaridad celular. La mayoría de los datos y ejemplos presentados aquí están utilizando las células epiteliales vaginales cultivadas en el sistema RWV, sin embargo, el sistema RWV también se ha utilizado para cultivo de otros tipos de células epiteliales incluyendo intestino delgado y grueso, pulmón, de vejiga, el hígado, y las células epiteliales amigdalinos para formar modelos 3-D organotípicos 1, 7-13, 18. Además, este sistema se ha utilizado para los tipos de cultivo de células distintas de las células epiteliales, y en la actualidad el desarrollo de complejo, multicellular modelos de la cultura organotípicos están en marcha 2, 18.
Los protocolos descrito aquí están destinados a servir como una guía, y puede ser necesario modificar en base al tipo de célula de interés. Las modificaciones más comunes en el protocolo para el cultivo de células epiteliales en el sistema RWV incluyen la longitud de tiempo que las células se cultivan en el STLV, decisión y el momento de la transferencia global de la STLV al HARV, y la proporción de células / perla para la inicial siembra en la STLV. Una modificación más especializado que puede ser considerado para la formación de agregados éxito son las propiedades de la perla microsoporte o andamio, como superficie, diámetro, forma, recubrimientos superficiales, la densidad, la carga, material de núcleo, y la porosidad. Además, los ajustes al medio de cultivo de base, la formulación, o suplementos, puede ser necesario para optimizar las condiciones de cultivo y maximizar la formación de agregados. Los ajustes también se puede hacer que el sistema de biorreactores y sus componentes, enincluyendo el tamaño del recipiente biorreactor y la velocidad de rotación. Para una evaluación mejorada de la microambiente dentro del biorreactor, un sistema de cultivo perfundido también está disponible que permite la monitorización continua de los niveles de pH, el oxígeno y la glucosa dentro del recipiente de cultivo asegurar un ambiente prolífico para la formación de agregados. El tiempo potencialmente largo para optimizar las condiciones de cultivo, la formación de agregados, la diferenciación celular y para caracterizar cada sistema nuevo modelo, así como el gasto inicial del sistema biorreactor, son inconvenientes notables a este sistema. Sin embargo, cualquier sistema de cultivo nuevo implementado en un laboratorio tienen desventajas similares.
Nosotros y otros han demostrado que RWV derivados de los modelos que utilizan las células humanas pueden ser una herramienta valiosa para predecir la eficacia, toxicidad y la farmacocinética de vacunas, microbicidas, productos biológicos y farmacéuticos de una manera que sea relevante para los seres humanos 1, 2, 18. Con el éxito de ªes el sistema de biorreactor de cultivo para producir auténticas respuestas humanas, junto con su flexibilidad, las aplicaciones del sistema de biorreactor RWV Actualmente se está ampliando a otros campos como el modelado del tumor, la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos 2, 18-23. Para hacer avanzar nuestros RWV modelos generados por la mucosa que están trabajando para crear un sistema multicelular más complejo que se replica tanto en la estructura y la función del tejido mucoso humano. Sin embargo, los autores reconocen que puede ser necesario utilizar o integrar varios sistemas modelo para reproducir las complejas interacciones que las drogas o vacunas tienen con los sistemas fisiológicos humanos. En general, nuestro objetivo de utilizar el biorreactor RWV y sus aplicaciones experimentales para entender mejor la biología de las mucosas y las respuestas celulares a las agresiones ambientales en los modelos humanos de organotípicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Brooke Hjelm por su experiencia técnica y Andrew Larsen por su análisis de proteínas. Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación de Investigación de Alternativas para el Desarrollo (MMHK) y el NIH Grant NIAID Infecciones de Transmisión Sexual y microbicidas tópicos Centro de Investigación Cooperativa IU19 AI062150-01 (MMHK). Agradecemos Biología de la Reproducción para la reutilización de las cifras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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