Summary
Вращающейся системе культуры клеток эпителия, который позволяет клеткам расти в физиологических условиях в результате 3-D сотовой формировании совокупного описано. Агрегаты порожденных дисплей
Protocol
Все шаги должны быть выполнены в соответствии BSL-2 в условиях ламинарном боксе.
1. Подготовка STLV биореактора
- Соберите STLV биореактора в соответствии с протоколом производителя и выполнять детоксикации протоколов для обеспечения стерильности в биореактор. Обложка открытых портов с Luer шапки и заполнить STLV с 95% этанола в течение 24 часов.
- Удалить этанола и заполнить STLV стерилизованной дистиллированной водой в течение 24 часов.
- Повторите шаг 1.2 с стерилизовать только дистиллированную воду.
- С помощью инструмента поставляется поставщиком, ослабьте все болты, колпачки и центр вилку из STLV и автоклаве при 110 ° C в течение 20 мин в стерилизации упаковки.
- После STLV охлаждается, затянуть винты и повторите шаги 1.1-1.4 для обеспечения стерильности и полной детоксикации.
- Затяните винты охлаждаются STLV и винт на предварительно стерилизованных односторонним краны для каждого порта.
- Открытое кран, поместив ручки вертикально.
- Снимите поршни от 10 мл и 5 мл Луер-Лок шприц и вновь рукава плунжеров еще в обертки для поддержания стерильности. Винтовые шприцы на краны (Луер-Лок шприцы кончик необходимых для этого шага).
- Добавить Дульбеко фосфатном буферном растворе (DPBS) в 10 мл шприц до STLV полно и начинает заполняться 5 мл шприц.
- Замените стерильной плунжеров в каждый шприц и удалить остатки пузырьков происходит в биореакторе на чередуя вождения плунжеров шприцы.
- Оставьте шприц прилагается к биореактор после удаления всех пузырей. Закрыть краны и приложить STLV к вращающейся платформой и вертикальным вращаться в течение как минимум 24 часов для отслеживания утечек.
2. Подготовка микроносителей бисера
- Добавить 15 мл DPBS до ~ 250 мг cytodex микроносителей бусины в 50 мл коническую трубку и автоклаве при тех же условиях, что и STLV (1.4).
- После охлаждения, удалить DPBS, добавить средства массовой информации используются для выращивания эпителиемАль ячейки интерес, и вихрь трубы для ресуспендирования бисера.
- Повторите шаги мыть со средствами массовой информации еще два раза. После последней промывки добавить 15 мл средства массовой информации роста бисера.
3. Посев эпителиальных клеток и бисер в STLV биореактора
- Рост клеток эпителия интерес как монослоев в колбах культуре ткани до получения ≥ 1х10 7 клеток. Удалить клеток из колбы (т.е. trypinsization, ЭДТА), рассчитывать клеток установить сотовой концентрации, и определить жизнеспособность сотовой трипанового синего окрашивания исключения 1.
- В коническую трубку с подготовленными бисером (см. п. 2.3), добавить необходимые концентрации клеток (2x10 5-1x10 7 эпителиальных клеток) 2, 8, в зависимости от типа клеток эпителия о намерениях (рис. 1А). Убедитесь, что все клетки передаются полоскания коническую трубку.
- Удалить DPBS и шприцы с STLV.
- Удалить заглушку с порта центре и добавить в эпителиальныхELL / шарик суспензии в STLV с помощью 10 мл серологические пипетки. Промыть конические трубки, чтобы обеспечить все клетки / бисер передаются STLV и заменить центре порта вилкой.
- Удалить из плунжеров 5 и 10 мл шприцев и вновь рукава поршни обратно в обертки для поддержания стерильности. Винтовые шприцев в портах с открытыми кранами. Заполните STLV со средствами массовой информации, заменить поршни, и близко кранами.
- Поместите вновь посеяны STLV в 37 ° C инкубаторе в течение 30 минут, без вращения.
- Открытые краны, удаления пузырьков использованием плунжеров, а затем закройте краны.
- Поместите STLV в 37 ° C, 5% СО 2 увлажненном инкубаторе вращающийся на 20 оборотов в минуту (рис. 1б). Культура должна быть повернута непрерывно 24 часа в сутки, за исключением при отборе проб, изменение средств массовой информации, или сбора агрегатов (см. следующий раздел).
4. Культивирование, отбор проб, и фото документация культур
- После первоначального 96-120 ч культивирования клеток в два разаoreactor, изменение средств массовой информации, наклоняя STLV и позволяет клеткам / бисером, чтобы обосноваться. Удалить шприцы, как открыть запорные краны, и слить ~ 75% от средств массовой информации со стороны порта (рис. 1в). На основе клеточного метаболизма средств массовой информации, изменение средств массовой информации каждый день или через день после первого посева и 96-120 ч культуре периода.
- Винт на 5 и 10 мл шприцев недействительным плунжеров и следовать протоколу повторного кормления, как описано выше (1.7-1.11), то винт закрытой задней STLV место на вращающейся платформе.
- Мониторинг роста и жизнеспособности агрегатов каждые 5-7 дней после посева в STLV тщательно удаляя небольшое количество агрегатов (~ 200 мкл) от центра порта на два 1,5 мл пробирок. Чтобы избежать совокупного сдвига, для всех агрегатных переводы использовать 1000 мкл кончика пипетки, разрезанные ~ 2 см от места и стерилизовать.
- Замените центр вилку, обмен новыми шприцами, добавить свежие СМИ STLV, как описано выше (1.7-1.11), и поместить обратно в STLVИнкубатор с вращением (см. 3.8).
- Для контроля сотовой жизнеспособность, используя один из двух 1,5 мл трубки агрегатов аликвоты в пункте 4.3, и удаляют клетки из бисера таким же образом, эпителиальные клетки удаляются из тканевой культуры фляги (т.е. трипсинизации). Мониторинг жизнеспособность трипанового синего окрашивания исключения 1.
- Для визуализации сотовых агрегатов, добавляют 0,5-1 мл СМИ на второй агрегат 1,5 мл аликвоты и передачи небольших чашках Петри помощью отсечения 1000 мкл кончиком пипетки. Изображение агрегатов использованием инвертированного микроскопа свет (рис. 1D).
5. Передача и сбор урожая агрегатов
- Для некоторых моделей эпителиальные клетки необходимо передать агрегатов одноразовые HARV увеличить аэрацию культуры 2. Примерно за неделю до уборки агрегатов для анализа, удаление шприцев и краны из STLV и слить ~ 50% от средств массовой информации со стороны порта.
- РемОве центр подключить STLV и осторожно вылейте все содержимое в 50 мл коническую трубку с центральным портом (рис. 1Е). Промойте STLV в два раза с 5 мл средства массовой информации и объединить промыть остальные агрегаты.
- Продолжить с передачей агрегатов, как описано в 5.2, но передача агрегатов из 50 мл коническую трубку HARV.
- Тщательно урожай агрегатов HARV после ~ 1 недели или STLV (по типу клеток), как выше было выполнено (5.2). См. ниже потенциального форматов анализ, анализы и анализ после совокупный урожай.
6. Потенциальные анализ, приложения и анализы проводились с Агрегаты
- Посев агрегатов для различных экспериментальных форматов. Передачи необходимого количества агрегатов из 50 мл коническую трубку с 1,5 мл трубки, 24-луночный планшет, или 96 пластины с использованием стерилизованных отсечки 1000 мкл кончиком пипетки (рис. 1F).
- Стиральные и подготавливаетв G агрегатов для анализа. Удалить СМИ после агрегаты были урегулированы. Внесите DPBS непосредственно к центру трубки или хорошо, так что все агрегаты вызвала. После агрегатов осели вниз, удалить DPBS и повторить столько раз, сколько необходимо.
- Доставка агрегатов за пределами объекта эксперимента и анализа. Добавить необходимое количество агрегатов на 50 мл трубку и мыть агрегаты, как в п. 6.2. Полностью заполнить 50 мл трубку со средствами массовой информации, шапочка, и парафильмом вокруг крышки, чтобы избежать утечки. Надежно поставлять агрегаты в нужное место на ночь при комнатной температуре.
- Крепление агрегатов для электронной микроскопии (рис. 2). Сканирование, передача или иммуно-электронная микроскопия может осуществляться путем передачи 150-300 мкл агрегатов 1,5 мл трубки и стиральные агрегаты 3 раза DPBS (6.2). Добавить 200 мкл для конкретных приложений (SEM, TEM, иммуно-EM и т.п.) электронной микроскопии фиксатором для желаемого инкубационного периода. Удалить исправить, мыть aggregatх годов в 2 раза с DPBS, и приступить, как указано в Хельм и соавт. 2010 для сканирования и просвечивающей электронной микроскопии 2.
- Иммунофлуоресценции изображений микроскопии (рис. 3). Передача ~ 100 мкл агрегатов 1,5 мл трубки и мыть агрегаты (6.2). Исправлено и этикетки агрегатов с антителами в аналогичных условиях, как с моно, за исключением 1,5 мл трубки. Для установки поместите 1 каплю монтаж средств массовой информации на предметном стекле микроскопа, передачи меченых агрегатов на верхней части установки средств массовой информации с отсечения 1000 мкл кончика пипетки, место покровное на агрегаты, печать с покровным лаком для ногтей, и сухой слайд ночь 2.
- Измерение сотовой жизнеспособность / распространение использованием МТТ-анализа (рис. 4). Передача агрегатов на 24-луночного планшета и замену средств массовой информации с 625 мкл фенола красного свободных средств массовой информации. Добавить 62,5 мкл 5 мг / мл тиазолил тетразолия бромид (МТТ) в каждую лунку и инкубировать в течение 4 ч при температуре 37 ° C. Добавить 625 мкл 100 мг / мл SDS-0,01М HCl в каждую лунку и инкубировать в течение ночи. Считать абсорбцию при 570 нм и получать% жизнеспособность клеток по формуле:
- Токсикологические исследования. Передача агрегатов до 24-луночного планшета и выполнять трипанового синий исключении на ≥ 2 скважины для начальной жизнеспособности клеток / концентрации. Добавить тест соединения в диапазоне концентраций дублировать скважин. Для жизнеспособности клеток (рис. 5А), мыть агрегаты и выполнять трипанового синий исключении после лечения. Для TC 50 (рис. 5B), взять сотовые жизнеспособность дубликат скважин для каждой концентрации с течением времени и использовать Рид Мюнх метод определения концентрации токсичных 50% 2, 15.
- Цитометрии шарик массив (ЦБА) или ИФА. Сотовые супернатантах может быть принято после посева клеток в эксперименте формате диаграмм. Стимулировать семенами агрегатов, как и клетки, выращенные в качествемонослоев, собирают супернатанты (≥ 120 мкл) и хранить при -80 ° C для анализа методом ИФА или ЦБ (рис. 6).
- РНК анализа. Передача ≥ 500 мкл агрегатов до 1,5 мл трубки и мыть агрегаты с DPBS. Продолжить экстракция использованием Qiagen RNAeasy комплект и протокол для клеток животных с гомогенизации лизат с использованием 20-иглы. Убедитесь в том, чтобы бисер оседают на дне трубки, до передачи супернатант, и не переносят пустых бисером спин колонки (бисер будет забивать колонке мембраны приводит к снижению доходности РНК) (рис. 7).
- Белки анализа. Урожай агрегатов под теми же методами, с использованием монослоя 1,5 мл трубки или более экспериментальный формат. Однако, после лизиса агрегаты, позволяющие решить бисером и передачи лизат в отдельную трубу перед запуском гель белка или других форм анализа белков (рис. 8).
- Инфекцияисследований. Семени агрегатов в нужный экспериментальный формат. Используйте как минимум двух скважин / образцов для trypsinizing клеток из бисера перечислить количество клеток и количественного жизнеспособности клеток. Инфекция агрегатов с возбудителем интереса в отдельных множественности инфекции осуществляется с клетки, выращенные как монослоя (рис. 9). Wash шаги должны быть выполнены как в п. 6.2.
- Проточная цитометрия: Семенной агрегатов в 50 мл трубы, мойка агрегатов (6.2), и добавить 2 мМ ЭДТА в течение 5-10 мин при температуре 37 ° C. Добавить 5-10 мл средства массовой информации в клетки и клетки проходят через ячейки фильтра. Алиготе 1x10 6 клеток в трубку полипропилена и стирка в холодной клетки блокирующим раствором (1% FBS в PBS). Ресуспендируйте клеток с антителами и инкубировать в зависимости от производителя. Вымойте клеток путем центрифугирования, ресуспендируют в PBS, и передача клетки для фильтрации трубки для анализа (рис. 10).
7. Представитель Результаты
Примеромдифференцированных человеческих эпителиальных совокупности выросли в системе биореактора STLV можно увидеть на рисунке 2. SEM и TEM изображения собраны из человеческих вагинальных клеток, выращенных в STLV на 39 дней, где microridges, инвагинации, внутриклеточные везикулы секреторную и микроворсинок на апикальной поверхности можно наблюдать. Дальнейшие демонстрации в естественных условиях, как характеристика эпителиальных клеток, выращенные в биореакторе можно наблюдать с помощью конфокальной микроскопии иммунофлуоресценции изображения (рис. 3) 3-D клеток вагинального выражения муцина (MUC1) и маркеров, специфичных для эпителиальных клеток (ЕКА) и терминальной дифференцировки (Involucrin; INV).
Как показала практика, 3-D отображение агрегатов ультраструктурные особенности, подобные ткани, однако их более физиологически соответствующих фенотипов также служить в качестве отличной платформы для оценки токсичности веществ. Анализ МТТ, широко используемый тест для оценки жизнеспособности клеток, обмена веществ и пролиферацииТион, может быть использован для измерения токсичности различных химических веществ и соединений (рис. 4). Тритон Х-100, моющие средства, которые разрушают клеточные мембраны, был использован в качестве положительного контроля для проверки МТТ анализа. Дополнительный метод для измерения токсичности после лечения тест соединений трипанового синего исключения (рис. 5). После лечения с ноноксинол-9 (N-9), вагинальный агрегаты продемонстрировали токсичность ответ похож на шейный модели эксплантов, но другого профиля по сравнению с 2 монослоев, 16.
Дополнительные исследования, которые демонстрируют способность эпителиальных клеток, выращенные в биореакторе, функционировать и сигнал аналогично ткани в естественных условиях, можно наблюдать на рисунке 6. При стимуляции с молекулами происходит от микробов, которые признаны Толл-подобные рецепторы (TLR), агрегаты отвечают и выделять провоспалительных цитокинов, включая IL-6 1.Экспрессия рецепторов прогестерона (PR), рецептор, который реагирует на гормональной стимуляции, можно наблюдать и в вагинальном клетки как на РНК и белка (рис. 7 и рис 8, соответственно). 3-D агрегаты не только иметь возможность реагировать на возбудителя и гормон молекулы, но также в состоянии поддерживать функционально вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) инфекции. Конфокальной микроскопии изображение ВПГ-2 инфицированным 3-D вагинальный агрегатов (рис. 9) показывает, инфекции. Параллельная 2-D влагалищного эпителия клеточных культур не показываются в результате тяжелой сотовой разрушения, вызванные ВПГ-2 инфекции. RWV-производных 3-D агрегаты были также использованы для количественного бактериальной и вирусной репликации с помощью внутриклеточных кривых роста и доска анализы, соответственно 8, 9. И, наконец, физические и функциональные свойства отдельных клеток в агрегатах также могут быть количественно с помощью проточной цитометрии. Для exampле, мы использовали тест проточной цитометрии для оценки MUC1 поверхности выражение отдельных вагинальные клетки (рис. 10). Вагинальные 3-D агрегатов выразили низкий процент MUC1 (27,7%) по сравнению с моно (67,2%). Низкий процент MUC1 на 3-D поверхности агрегатов по сравнению с монослои может быть результатом большинства MUC1 время выделяется из клеток наблюдается в вагинального тракта 17, 18.
Рисунок 1. Схема для культивирования человеческих эпителиальных клеток в RWV и потенциальных приложений, использующих RWV производных агрегатов.) Эпителиальные клетки сначала выращивают как монослоев в колбе культуре ткани. После сливной клетки удаляются из колбы и в сочетании с бисером микроносителей в биореакторе STLV. Шкала бар. 80 мкм B) STLV вращается на платформу для создания постоянной среде, свободной от падения низкой еLUID сдвига, что позволяет клеткам и размножаются на четках образуя видимые сотовых агрегатов. C) После 96 часов, средств массовой информации в STLV должны быть изменены, чтобы приспособить для клеточного метаболизма. Средства массовой информации выливается в сторону порта, свежие медиа заменяется через прилагаемый шприц 10 мл (поршень удалены), а поршни шприцев заменены и используется для выдавливания пузырей. D) После ~ 5 дней (д) агрегаты начинают формироваться . Агрегаты отбираются каждые 7 дней и отображаемого с помощью световой микроскопии для контроля за их развитием прогрессии (20x увеличением 3-D человеческих эпителиальных клеток вагинального). E) После завершения образования агрегатов и клеточной дифференцировки произошло, агрегаты собирают из биореактора и переносят в 50 мл коническую трубку. F) Агрегаты могут быть посеяны на 1,5 мл трубки или нескольких хорошо пластины формата для проведения экспериментального исследования и анализы. G) План Потье ntial тестов и анализов, которые могут быть проведены на агрегатах. Это представительский список анализ не претендует на исчерпывающий каталог всех потенциальных приложений вниз по течению.
Рисунок 2. Изучение морфологических и структурных характеристик 3-D эпителиальные клетки агрегатов с помощью электронной микроскопии. (А), сканирующей электронной микроскопии (SEM) образ 3-D человеческих эпителиальных вагинальных совокупности клеток. Масштаб бары: 200 мкм (100x), 100 мкм (200x), 50 мкм (500x). Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) образ 3-D человека эпителиальные клетки вагинального совокупности со стрелками (B) внутриклеточные везикулы секреторную и микроворсинок или (C) "цитоплазматических процессов». Масштаб бары: 2 мкм (с изменениями от Хельм и др. 2010г.) 2.
g3.jpg "/>
Рисунок 3. Конфокальной микроскопии иммунофлуоресценции используется для идентификации соединительных дифференциации и белков-маркеров в 3-D эпителиальные клетки агрегатов. Человека 3-D вагинальных клеток, полученных из биореактора после 32 дней, фиксированных и окрашенных (A) муцина антител MUC1, (B) антитела, специфичные для эпителиальных клеток, ЕКА, или (C) анти-Involucrin (INV) антитело, которое распознает терминально дифференцированных клеток эпителия. Агрегаты были косвенно помечены Alexa 488 вторичных антител (зеленый). Шкала бар: 60 мкм (с изменениями от Хельм и др. 2010г.) 2.
Рисунок 4. МТТ тест используется для измерения сотовой жизнеспособность. Человека 3-D вагинальный агрегаты были посеяны в 24-луночного планшета и обрабатывают СМИ в одиночку (без лечения) или 0,01%, 0,1% или 1,0% Тритон Х-100 моющее средство в течение 1 ч при температуре 37 ° C. Followin г лечение, средства массовой информации была удалена и анализа МТТ был выполнен для измерения сотовой жизнеспособность. Представляет ** р <0,001; односторонний Стьюдента-тест сравнения Тритон Х-100 обработанных клеток с необработанным контролем.
Рисунок 5. Использование 3-D эпителиальные клетки агрегатов на экране токсичность соединений. (А), ноноксинол-9 (N-9) дозозависимое кривая жизнеспособности 24 ч после обработки 3-D человека влагалищного эпителия модель клетки (красная линия / бар) по сравнению с же типа клеток выращивают как сливной монослоя (черная линия / бар). (B) N-9 TC 50 уровней влагалищного эпителия клеточных культур в (A) на 1,5 часа, 4 часа, 8 часов и 24 часов после лечения. * Представляет р <0,05; односторонний Стьюдента-тест сравнения монослоев в 3-D клеток в каждой экспозиции. (С изменениями по Хельм и соавт. 2010) 2.
/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Анализ продукции цитокинов в 3-D эпителиальных клеток в ответ на звонок, как рецепторы (TLR) агонист стимуляции. Три-D человека вагинальные клетки стимулировали FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), флаг (TLR5) и CL097 (TLR7 / 8) в течение 24 ч и секретируемых цитокинов измеряли цитометрии шарик массива. IL-6 показано, как представитель провоспалительных цитокинов производства и измерить. * Представляет р <0,05; односторонний Стьюдента-тест сравнения стимулировали образцы PBS группы. (С изменениями по Хельм и соавт. 2010) 2.
Рисунок 7. Контроль экспрессии генов в 3-D эпителиальных клеток. Полу-количественный ПЦР-анализ рецепторов прогестерона (PR) выражение в монослоя (ML) или 3-D человека вагинальных эпителиальных клеток. GAPDH показан как управления загрузкой. Усиление продукцииуказаны в результате стенограмму выражений, имевших место после 30 циклов ПЦР. стрелок указывают на PR группы только происходящих в 3-D образца.
Рисунок 8. Экспрессии белка анализа 3-D эпителиальных клеток. Вестерн-блот анализе монослоя и 3-D человека вагинальных эпителиальных клеток все клеточные лизаты (30μg) исследовали с анти-рецепторов прогестерона (PR) антител. β-тубулина был использован в качестве зонда для загрузки контроля.
Рисунок 9. Три-D человека эпителиальные клетки модель поддерживает продуктивной вирусной инфекции. Конфокальной микроскопии иммунофлуоресценции изображения 3-D человека влагалищного эпителия совокупности клетки, инфицированные ВПГ-2. Клетки были заражены при МВД 1.0 в течение двух часов, промывают, фиксированных 24 часов после заражения (4% PFA) и окрашивали ВПГ-2 с конкретными VP5apsid антител (зеленый) и ядерной окраски DAPI (синий). Шкала бар: 50 мкм.
Рисунок 10. Индивидуальный анализ клетки в 3-D модель человеческого эпителия клетки с помощью проточной цитометрии. (A) монослоя или (B) 3-D человека влагалищного эпителия агрегаты были диссоциированы с ЭДТА, меченные FITC конъюгированных антител MUC1 (синий), изотипа управления (зеленый), или PBS (красный), и FITC выражение количественно проточной цитометрии. Номера представляют собой процент клеток, которые окрашивали положительный муцина антитела, которые остались после Память фоновой флуоресценции от изотипа контроль окрашенных клеток. Неоднородные пики являются результатом множества glycosolation модели и разные уровни MUC1 на поверхности этих клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование технологии RWV биореактор, представленные здесь может дать исследователям возможность для продвижения своей нынешней системе культуры клеток на более физиологически соответствующих органотипической модели культуры клеток. Ячейка RWV биореактор культуры система обеспечивает низкий микроокружения сдвига, что позволяет клеткам формировать 3-D сотовых агрегатов в естественных условиях подобные характеристики, включая плотные соединения, муцина производство внеклеточных процессов (например, микроворсинки), а также сотовые полярности. Большая часть данных и примеры, представленные здесь используют вагинальные эпителиальных клеток, выращенных в системе RWV, однако система RWV также был использован для культуры других типов клеток эпителия в том числе тонкой и толстой кишки, легких, мочевого пузыря, печени и эпителиальных клетках миндалин форме 3-D модели органотипической 1, 7-13, 18. Кроме того, эта система была использована для культуры клеток, отличные от эпителиальных клеток, и в настоящее время разработки сложных многоклеточныхlular органотипической модели культуры есть 2 стадии, 18.
Протоколы, изложенные здесь призваны служить в качестве руководства, и, возможно, должны быть изменены основанные на типе клеток, представляющих интерес. Наиболее распространенные изменения в протокол для культивирования эпителиальных клеток в системе RWV включать продолжительность клетки культивировали в STLV, решения и сроки передачи от совокупности STLV к HARV, и клетки / гранулы соотношение для начальной посева в STLV. Более специализированные модификации, которые могут рассматриваться для успешного формирования совокупности являются собственностью микроносителей шарик или леса, такие как площадь, диаметр, форма, поверхность покрытия, плотность заряда, основного материала, и пористость. Кроме того, изменения в среде базы культуры, разработке, или добавки, которые могут потребоваться для оптимизации условий культивирования и максимального совокупного образования. Корректировки могут быть сделаны в систему биореакторов и ее компонентов, вcluding размера биореактора судна и скорости вращения. Для расширенной оценки микросреды в биореактор, перфузией системе культуры также доступна, который позволяет для непрерывного контроля рН, кислорода и глюкозы в культуре судно обеспечения плодовитый условия для образования агрегатов. Потенциально длительное время для оптимизации условий культивирования, образования агрегатов, клеточной дифференцировки и охарактеризовать каждую новую модель системы, а также начальный счет биореактора системы, заслуживают внимания, недостатки этой системы. Тем не менее, любая новая система культуры осуществляется в лаборатории будет иметь такие же недостатки.
Мы и другие показали, что RWV производных моделей использования человеческих клеток может быть ценным инструментом для прогнозирования эффективности, токсичности и фармакокинетике вакцины, бактерицидных средств, биологических и фармацевтических препаратов таким образом, что имеет отношение к людям 1, 2, 18. С успехом йявляется биореактор системе культуры для производства подлинных человеческих реакций, в сочетании с гибкостью применения системы биореактора RWV в настоящее время расширяется до таких областях, как моделирование опухоли, регенеративной медицины, и тканевой инженерии 2, 18-23. Для продвижения нашей RWV генерируемых слизистой модели мы работаем, чтобы создавать более сложные многоклеточные системы, которая повторяет структуру и функции человеческого слизистых тканей. Тем не менее, авторы признают, что это может быть необходимо использовать или интегрировать несколько модельных систем для воспроизведения сложных взаимодействий, что лекарства или вакцины с человека физиологических систем. В целом, наша цель использования RWV биореактор и его экспериментального приложения, чтобы лучше понять биологию слизистых тканях и клеточных реакций на неблагоприятная экологическая обстановка в человеческом органотипической моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Брук Хельм ее техническую экспертизу и Андрей Ларсена за его анализа белков. Эта работа была частично финансируется Альтернативы развития исследований Фонда (MMHK) грант NIH и NIAID передаваемых половым путем и противомикробных средств совместной научно-исследовательский центр IU19 AI062150-01 (MMHK). Мы выражаем глубокую признательность биологии размножения для повторного использования цифр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
