Summary
Rotierende Zellkultursystem, die Epithelzellen unter physiologischen Bedingungen, die sich in 3-D zellulären Aggregatbildung wachsen kann beschrieben. Die Aggregate erzeugt Display
Abstract
Zellen und Gewebe im Körper Erfahrung Umweltbedingungen, die ihre Architektur zu beeinflussen, interzelluläre Kommunikation, und die allgemeine Funktionen. Für In-vitro-Zellkultur-Modellen simulieren exakt um das Gewebe von Interesse ist das Wachstum der Kultur-Umgebung ein kritischer Aspekt zu betrachten. Üblicherweise verwendete konventionelle Zellkultursystemen ausbreiten Epithelzellen auf flachen, zweidimensionalen (2D) undurchlässige Oberflächen. Obwohl viel von herkömmlichen Zellkultursystemen erfahren haben, sind viele Ergebnisse nicht reproduzierbar in klinischen Studien am Menschen oder Gewebeexplantate, möglicherweise als Folge des Fehlens eines physiologisch relevanten Mikroumgebung.
Hier beschreiben wir eine Kultur-System, das viele der Kultur Bedingung Grenzen der 2-D-Zellkulturen überwindet, indem Sie die innovative drehbare Wand Gefäß (RWV) Bioreaktor-Technologie. Wir und andere haben gezeigt, dass organotypischen RWV-abgeleiteten Modelle können structur rekapitulierene, Funktion und authentischen menschlichen Reaktionen auf äußere Reize ähnlich wie bei menschlichen Geweben Explantat 1-6. Die RWV Bioreaktor ist eine Suspensionskultur, das für das Wachstum der Epithelzellen unter niedrigen Scherbedingungen physiologischen Flüssigkeit ermöglicht. Die Bioreaktoren in zwei verschiedenen Formaten, eine mit hohem Aspektverhältnis rotierenden Behälter (HARV) oder eine langsam drehende seitlichen Behälter (STLV), in denen sie sich durch ihre Belüftung Quelle stammen. Epithelzellen sind in den Bioreaktor der Wahl in Kombination mit porösen, Kollagen-beschichteten Mikroträgerkügelchen (1A) zugegeben. Die Zellen nutzen die Kügelchen als Wachstumsförderer Gerüst während der konstanten freien Fall in dem Bioreaktor (1B). Die Mikroumgebung des Bioreaktors vorgesehen ermöglicht es den Zellen dreidimensionalen (3-D) Anzeigen Aggregate in vivo-ähnlichen Eigenschaften zu bilden oft nicht unter Standard-2D-Kulturbedingungen (1D) beobachtet. Zu diesen Merkmalen gehören Tight Junctions, mucuns die Produktion, apikale / basale Orientierung, in vivo Protein-Lokalisierung und zusätzliche epithelialen Zelltyp-spezifische Eigenschaften.
Die Progression von einer Monoschicht von Epithelzellen zu einer ausdifferenzierten 3-D-Aggregat hängt vom Zelltyp 1, 7-13 basiert. Regelmäßige Stichproben aus dem Bioreaktor ermöglicht die Überwachung von epithelialen Aggregatbildung, die zelluläre Differenzierung Marker und Lebensfähigkeit (1D). Wenn die zelluläre Differenzierung und Aggregatbildung hergestellt wird, werden die Zellen aus dem Bioreaktor entnommen, und ähnliche Assays 2-D-Zellen durchgeführt werden, um den 3-D-Aggregate mit einigen Überlegungen (1E-G) aufgebracht werden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine detaillierte Schritte, wie die Kultur 3-D-Epithelzellen Aggregate in der RWV Bioreaktor und eine Vielzahl von möglichen Tests und Analysen, die mit den 3-D-Aggregate ausgeführt werden kann. Diese Analysen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, strukturelle / morphological Analyse (konfokale, Raster-und Transmissions-Elektronenmikroskopie), Zytokin / Chemokin Sekretion und Zell-Signalisierung (Cytometric Bead Array-und Western-Blot-Analyse), Genexpressionsanalysen (real-time PCR), toxikologischen / Drogen Analyse-und Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Verwendung dieser Assays legte den Grundstein für tiefer gehende Studien und expansiv wie Metabolomik, Transcriptomics, Proteomics und andere Array-basierten Anwendungen. Unser Ziel ist es eine nicht-konventionelle Mittel zur Kultivierung humaner Epithelzellen zu organotypischen 3-D-Modelle, die das menschliche Gewebe in vivo zu rekapitulieren, in einer einfachen und robusten System, um die von Forschern mit vielfältigen wissenschaftlichen Interessen verwendet werden produzieren zu präsentieren.
Protocol
Alle Schritte sollten unter BSL-2 Bedingungen in einer sterilen Werkbank durchgeführt werden.
1. Vorbereiten des STLV Bioreaktor
- Montieren Sie den STLV Bioreaktor nach dem Protokoll des Herstellers und führen Entgiftung Protokoll, um die Sterilität des Bioreaktors zu gewährleisten. Decken Sie offene Ports mit Luer-Kappen und füllen Sie den STLV mit 95% Ethanol für 24 h.
- Ethanol entfernen und füllen Sie den STLV mit sterilisiertem destilliertem Wasser für 24 Stunden.
- Wiederholen Sie den Schritt 1.2 mit sterilisiertem destilliertem Wasser nur.
- Mit dem Tool von Lieferanten geliefert, lösen Sie alle Schrauben, Kappen und Stecker aus der Mitte STLV und Autoklaven bei 110 ° C für 20 min in einen Sterilisations-Beutel.
- Sobald die STLV gekühlt wird, ziehen Sie die Schrauben und wiederholen Sie die Schritte von 1,1 bis 1,4, um die Sterilität und vollständige Entgiftung zu gewährleisten.
- Ziehen Sie die Schrauben von den STLV gekühlt und schrauben Sie vor sterilisiert Einweg-Hähne an jedem Port.
- Open-Hahn durch die Positionierung der Knöpfe vertikal.
- Entfernen Sie die Kolben aus einer 10 ml und 5 ml Luer-Lock-Spritze und Re-Ärmel Kolben zurück in Wrapper, um die Sterilität zu erhalten. Schrauben Sie Spritzen auf Hähne (Luer-Lock-Spitze Spritzen sind für diesen Schritt erforderlich).
- In Dulbeccos Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) an die 10 ml Spritze, bis der STLV voll ist und beginnt, die 5 ml Spritze zu füllen.
- Ersetzen Sie die sterile Kolben in jeder Spritze und entfernen Restblasen auftretenden Bioreaktor durch einen Wechsel zwischen treibenden Kolben der Spritzen.
- Lassen Sie die Spritzen an Bioreaktor nach dem Entfernen Sie alle Luftblasen. Schließen Hähne und befestigen Sie den STLV an der rotierenden vertikalen Plattform und drehen für ein Minimum von 24 h bis auf Dichtheit zu überwachen.
2. Vorbereiten Mikroträgerkügelchen
- Fügen Sie 15 ml DPBS auf ~ 250 mg Cytodex Mikroträgerkügelchen in einem 50 ml konischen Röhrchen und Autoklaven unter denselben Bedingungen wie der STLV (1,4).
- Nach dem Abkühlen entfernen DPBS, fügen Sie Medien verwendet werden, um zu wachsen epithelialenal Zelle von Interesse, und Wirbelrohr, um Perlen zu resuspendieren.
- Wiederholen Sie die Schritte waschen mit Medien zwei weitere Male. Nach dem letzten Waschen mit 15 ml Wachstumsmedium, um Perlen.
3. Seeding Epithelzellen und Perlen in den Bioreaktor STLV
- Wachsen epithelialen Zellen von Interesse als Monoschichten in Gewebekulturflaschen bis ≥ 1x10 7 Zellen zu erhalten. Entfernen von Zellen aus dem Kolben (dh trypinsization EDTA), zu zählen Zellen zelluläre Konzentration herzustellen und zu bestimmen Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss-Färbung 1.
- Um die konische Röhrchen mit vorbereiteten Beads (siehe 2.3), fügen Sie gewünschte Konzentration von Zellen (2x10 5-1x10 7 Epithelzellen) 2, 8, abhängig von Ihrem Epithelzelle Art of Intent (Abbildung 1A). Sicherstellen, dass alle Zellen durch Spülen der konischen Rohr übertragen werden.
- Entfernen Sie DPBS und Spritzen aus dem STLV.
- Ziehen Sie den Stecker vom Zentrum Port und fügen Sie den epithelialen cell / Bead-Suspension in das STLV Verwendung von 10 ml serologische Pipette. Spülen Sie konischen Rohr, um sicherzustellen, dass alle Zellen / Perlen der STLV übertragen werden und ersetzen Zentrum Port-Stecker.
- Entfernen Sie aus einem Kolben 5 und 10 ml-Spritzen und Re-Ärmel Kolben zurück in Wrapper, um die Sterilität zu erhalten. Schrauben Sie Spritzen in Häfen mit offenen Hähnen. Füllen Sie den STLV mit Medien, Kolben ersetzen, und in der Nähe Hähne.
- Legen Sie die neu ausgesät STLV in einem 37 ° C Inkubator für 30 min ohne Drehung.
- Offene Hähne, entfernen Blasen mit Kolben, und schließen Sie dann Hähne.
- Setzen Sie den STLV in einem 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator mit 20 UpM rotierenden (Abbildung 1B). Kulturen müssen ständig gedreht werden, 24 Stunden am Tag außer bei der Probenahme, wechselnde Medien, oder Ernte-Aggregate (siehe nächster Abschnitt).
4. Die Anzucht, Probenahme und Foto-Dokumentation der Kulturen
- Nach einer anfänglichen 96-120 h Kultivieren von Zellen in dem Bioreactor, wechseln Sie das Medium durch Kippen des STLV und ermöglicht den Zellen / Perlen zu begleichen. Spritzen entfernen, öffnen Sie beide Hähne, und abgießen ~ 75% der Medien von der Seite Port (Abbildung 1C). Basierend auf den Zellstoffwechsel von Medien, Medien verändern jeden Tag oder jeden zweiten Tag nach dem Initial Seeding und 96-120 h Kulturzeit.
- Schrauben auf 5 und 10 ml-Spritzen Leere der Kolben und folgen refeeding Protokoll wie oben beschrieben (1,7-1,11), dann schrauben Sie schloss das STLV wieder an Ort und Stelle auf rotierenden Plattform.
- Überwachen Wachstum und die Lebensfähigkeit von Aggregaten alle 5-7 Tage nach dem Aussäen in die STLV durch vorsichtiges Entfernen einer kleinen Menge von Aggregaten (~ 200 ul) vom Zentrum Port in zwei 1,5 ml Gefäße. Zu aggregieren Scherung zu vermeiden, für alle Transfers mit einem aggregierten 1000 L Pipettenspitze, die ~ 2 cm aus dem Punkt geschnitten und sterilisiert.
- Ersetzen Zentrum Stecker, Austausch mit neuen Spritzen, fügen Sie frisches Medium an die STLV wie oben beschrieben (1,7-1,11), und legen Sie die STLV zurück in dieInkubator mit Rotation (siehe 3.8).
- Für die Überwachung Zelllebensfähigkeit, verwenden Sie eine der beiden 1,5-ml-Tube-Aggregate in Schritt 4,3 aliquotiert, und entfernen Zellen aus Perlen in der gleichen Weise die Epithelzellen aus Zellkulturflaschen (dh Trypsinierung) entfernt werden. Überwachen Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss Färbung ein.
- Für die Bildgebung zellulären Aggregaten, fügen 0,5-1 ml Medium auf die zweite 1,5 ml Aliquot aggregieren und Transfer zu einer kleinen Petrischale mit einem cut-off 1000 L Pipettenspitze. Bild Aggregate unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops (1D).
5. Übertragen und Ernte Aggregate
- Bei einigen Modellen Epithelzelle ist es notwendig, um die Aggregate zu einem Einweg-HARV Belüftung der Kultur 2 zu erhöhen übertragen. Etwa eine Woche vor der Ernte Aggregate für die Analyse, zu entfernen Spritzen und Hähnen aus dem STLV und abgießen ~ 50% der Medien von der Seite Port.
- Remove der STLV Zentrum Stecker und vorsichtig alle Inhalte in einem 50 ml konischen Röhrchen aus Mittel-Port (1E). Spülen Sie die STLV zweimal mit 5 mL Medien und kombinieren spülen Sie mit anderen Aggregaten.
- Fahren Sie mit der Übertragung der Aggregate wie in 5.2 beschrieben, aber Transfer-Aggregate aus dem 50 ml konischen Röhrchen an den Harv.
- Sorgfältig Ernte-Aggregate aus dem HARV nach ~ 1 Woche oder von der STLV (basierend auf den Zelltyp) wie oben (5,2) durchgeführt. Siehe unten für mögliche Assay-Formate, Tests und Analysen im Anschluss Aggregat Ernte.
6. Potenzialanalyse, Anwendungen und Assays mit Aggregaten Geleitete
- Seeding Aggregate für verschiedene experimentelle Formate. Die gewünschte Menge von Aggregaten aus dem 50-ml konischen Röhrchen in ein 1,5 ml-Röhrchen, 24-Well-Platte, oder 96-Well-Platte unter Verwendung eines sterilisierten Hell-Dunkel-1000 L Pipettenspitze (1F).
- Waschen und die VorbereitungÝng Aggregate für die Analyse. Entfernen Sie das Medium nach Aggregate niedergelassen haben. Dispense DPBS direkt bis zur Mitte des Rohres oder gut, so dass alle Aggregate werden aufgewirbelt. Sobald Aggregate zu Boden abgesetzt, entfernen DPBS und wiederholen Sie so oft wie nötig.
- Liefer-Aggregate für Off-Site-Analyse und Experimentieren. Hinzufügen gewünschte Menge an Aggregaten zu einer 50 ml Tube und waschen Aggregate wie in 6.2. Vollständig zu füllen 50 ml Tube mit Medien, Mütze, Kappe und Parafilm rund um das Auslaufen zu vermeiden. Zuverlässig zustellt Aggregate an den gewünschten Ort über Nacht bei Raumtemperatur.
- Befestigung Aggregate für Elektronenmikroskopie (Abbildung 2). Scannen, Übertragung und Immuno-Elektronenmikroskopie kann durch Übertragen von 150 bis 300 ul Aggregate in ein 1,5 ml-Röhrchen und Waschen Aggregate 3 mal mit DPBS (6.2) durchgeführt werden. Fügen Sie 200 ul von anwendungsspezifischen (REM, TEM, Immuno-EM, etc.) Elektronenmikroskopie Fixativ für den gewünschten Inkubationszeit. Entfernen Sie fixieren, waschen AggregatES 2 mal mit DPBS, und gehen Sie wie in Hjelm et al beschrieben. 2010 für Raster-und Transmissions-Elektronenmikroskopie 2.
- Immunfluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 3). Transfer-~ 100 ul Aggregate zu einer 1,5-ml-Tube und waschen Aggregate (6,2). Fix und Label-Aggregate mit Antikörper unter ähnlichen Bedingungen wie bei Monoschichten, außer in einer 1,5-ml-Tube. Zur Montage, 1 Tropfen Eindeckmedium auf Objektträger übertragen markierte Aggregate oben auf Montage-Medien mit einem Cut-off 1000 L Pipettenspitze, ein Deckgläschen Aggregate-, Dichtungs-Deckglas mit Nagellack und trockenen Objektträger über Nacht 2.
- Messen der zellulären Lebensfähigkeit / Proliferation mittels MTT-Assay (Abbildung 4). Übertragen Aggregate auf eine Platte mit 24 Vertiefungen und ersetzen Medien mit 625 ul Phenolrot freien Medien. In 62,5 &mgr; l 5 mg / ml Thiazolylblau Blue Tetrazolium (MTT) in jede Vertiefung und inkubieren für 4 h bei 37 ° C Fügen Sie 625 ul 100 mg / ml SDS-0,01M HCl in jede Vertiefung und über Nacht inkubieren. Optische Dichte bei 570 nm und erhalten% Zellvitalität nach der Gleichung:
- Toxikologische Studien. Übertragen Aggregate bis 24-Well-Platte und führen Trypanblau-Ausschluss auf ≥ 2 Brunnen für erste Zelllebensfähigkeit / Konzentration. Fügen Sie Testverbindung bei Konzentrationen bis hin zu Duplikatvertiefungen. Für die Lebensfähigkeit der Zellen (5A), waschen und Aggregaten durchführen Trypanblau-Ausschluss nach der Behandlung. Für TC 50 (5B), nehmen zellulären Lebensfähigkeit der Doppelbestimmung für jede Konzentration im Laufe der Zeit und nutzen Reed Muench-Methode, um festzustellen, toxische Konzentration 50% 2, 15.
- Cytometric Bead Array (CBA) oder ELISA. Cellular Überstände können nach dem Aussäen Zellen in jeder experimentellen Format diagrammed genommen werden. Stimulieren Sie mit gesetzten Aggregate wie Zellen wachsen alsMonoschichten, sammeln Überstände (≥ 120 ul) und Speicher bei -80 ° C zur Analyse durch ELISA oder CBA (Abbildung 6).
- RNA-Analyse. Übertragen ≥ 500 ul von Aggregaten bis 1,5 ml Röhrchen und waschen Aggregate mit DPBS. Weiter Extraktion unter Verwendung von Qiagen-Kit RNAeasy und Protokoll für tierische Zellen mit Homogenisierung des Lysats mit 20-Gauge-Nadel. Vergewissern Sie sich zu lassen, Kügelchen am Boden des Röhrchens absetzen, vor der Übertragung Überstand, und übertragen nicht leer Perlen auf die Spin-Säule (Perlen wird Spalte Membran was zu niedrigen RNA-Ausbeute verstopfen) (Abbildung 7).
- Proteinanalyse. Ernte Aggregate unter den gleichen Verfahren wie mit Monoschichten unter Verwendung eines 1,5-ml-Röhrchen oder größer experimentellen Format. Jedoch nach der Lyse der Aggregate können die Kügelchen sich absetzen und das Lysat in ein getrenntes Röhrchen vor der Ausführung eines Protein-Gel oder eine andere Form der Protein-Analyse (8).
- InfektionStudien. Seed-Aggregate in die gewünschte experimentelle Format. Verwenden Sie mindestens zwei Brunnen / Proben für Trypsinieren Zellen aus Perlen auf die Zellzahl aufzuzählen und zu quantifizieren, die Lebensfähigkeit der Zellen. Infect Aggregate mit Pathogen von Interesse an ausgewählten Multiplizität der Infektion mit Zellen als Monolayer (9) angebaut durchgeführt. Waschschritte müssen die unter Nummer 6.2 durchgeführt werden.
- Durchflusszytometrie: Seed-Aggregate in 50 ml Tube, Wasch-Aggregate (6,2), und fügen Sie 2 mM EDTA für 5-10 min bei 37 ° C 5-10 ml Medium zu den Zellen und Zellen passieren durch ein Sieb Zelle. Aliquot 1x10 6 Zellen in einer Polypropylen-Röhrchen und Waschen der Zellen in kaltem Blockierungslösung (1% FBS in PBS). Die Zellen mit dem Antikörper und Inkubation nach Angaben des Herstellers. Waschen der Zellen durch Zentrifugation, in PBS resuspendiert, und Transfer-Zellen mit dem Rohr für die Analyse (10) zu filtern.
7. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispieldifferenzierte humane epitheliale Aggregat in der STLV Bioreaktorsystem angebaut werden kann in 2 gesehen werden. Die SEM-und TEM-Aufnahmen sind aus menschlichen Zellen in der Scheide STLV für 39 Tage gewachsen, wo microridges, Einstülpungen, intrazellulären Vesikeln und Mikrovilli auf der apikalen Oberfläche beobachtet werden können gesammelt werden. Weitere Demonstration der in vivo-ähnlichen Eigenschaften von Epithelzellen im Bioreaktor heranwachsen können mit Hilfe der konfokalen Immunfluoreszenz Bilder (Abbildung 3) von 3-D-Zellen, die vaginale Muzin (MUC1) und Marker spezifisch für Epithelzellen (ESA) und der terminalen Differenzierung beobachtet werden (Involucrin; INV).
Wie dargestellt, zeigt 3-D-Aggregate ultrastrukturelle Merkmale ähnlich wie Gewebe, aber ihre mehr physiologisch relevanten Phänotypen dienen auch als eine hervorragende Plattform für die Beurteilung Toxizität von Verbindungen. Der MTT-Assay, eine häufig verwendete Assay auf die Lebensfähigkeit der Zellen, den Stoffwechsel oder Proliferation zu messention, kann verwendet werden, um die Toxizität für verschiedene Chemikalien und Mittel (4) zu messen. Triton X-100, ein Reinigungsmittel, das Zellmembranen zerstört, wurde als positive Kontrolle für die Validierung des MTT-Assay verwendet. Ein weiteres Verfahren zur Toxizität nach Behandlung mit Testverbindungen zu messen, ist Trypanblau-Ausschluss (5). Nach der Behandlung mit der Nonoxynol-9 (N-9), zeigten die vaginale Aggregate eine Toxizität Antwort ähnlich, dass der Hals Explantat-Modelle, aber ein anderes Profil Monoschichten 2, 16 verglichen.
Weitere Studien, die die Fähigkeit von Epithelzellen in dem Bioreaktor gezüchtet, um funktionieren zu können und das Signal analog zu Geweben in vivo zeigen, kann in 6 beobachtet werden. Nach Stimulation mit Molekülen aus Mikroben, die von den Toll-like Rezeptoren (TLR) erkannt abgeleitet werden, reagieren die Aggregate und sezernieren pro-inflammatorische Zytokine, einschließlich IL-6 1.Die Expression des Progesteronrezeptor (PR), ein Rezeptor, der an Hormonbehandlung reagiert, kann es auch in den vaginalen Zellen sowohl auf RNA und Protein-Ebene (7 und 8, jeweils) beobachtet werden. Die 3-D-Aggregate nicht nur die Fähigkeit haben, Erregern und Hormon-Moleküle reagieren, aber auch in der Lage zu unterstützen funktionell ein Herpes-simplex-Virus Typ 2 (HSV-2)-Infektion. Eine konfokale Mikroskopie Bild von HSV-2 infiziert 3-D-vaginale Aggregate (Abbildung 9) zeigt Infektion. Parallel 2-D vaginalen Epithelzellkulturen nicht als Folge der starken zellulären Abbaus durch HSV-2-Infektion zeigten. RWV abgeleitete 3-D-Aggregate wurden auch verwendet, um bakterielle und virale Replikation durch intrazelluläre Wachstumskurven und Plaque-Assays quantifiziert, jeweils 8, 9. Schließlich können die physikalischen und funktionalen Eigenschaften der einzelnen Zellen innerhalb der Aggregate auch durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden. Für Blutzuckerwerle beschäftigten wir Durchflusszytometrie-Assay auf MUC1 Oberflächenexpression auf einzelnen vaginalen Zellen (Abbildung 10) zu messen. Vaginal 3-D-Aggregate ausgedrückt einen geringeren Anteil an MUC1 (27,7%) im Vergleich zu Monoschichten (67,2%). Die niedrigeren Prozentsatz von MUC1 auf der 3-D-Aggregate Oberfläche im Vergleich zu Monoschichten kann ein Ergebnis der Mehrheit von MUC1 aus den Zellen sekretiert im Vaginaltrakt 17, 18 beobachtet wird.
Abbildung 1. Schematische zur Kultivierung von menschlichen Epithelzellen in RWV und potentiellen Anwendungen RWV-abgeleiteten Aggregate. A) Epithelzellen werden zunächst als Monolayer in einer Zellkulturflasche gewachsen. Sobald der Konfluenz werden die Zellen aus Kolben entfernt und mit Mikroträgerkügelchen im STLV Bioreaktor. Maßstab:. B 80 um) Der STLV dreht sich auf einer Plattform, um einen konstanten freien Fall Umfeld niedriger f erstellenLUID Scherung, wodurch die Zellen zu befestigen und auf Kügelchen, wodurch sichtbare Zellaggregaten. C wachsen) Nach 96 h, die Medien in der STLV muss geändert werden, für den Zellstoffwechsel aufzunehmen. Die Medien durchgeführt wird einer Seitenöffnung gegossen, frisches Medium wird durch ein dazugehöriges 10 ml Spritze (Kolben entfernt) ersetzt, und Spritzenkolben ersetzt werden und verwendet werden, um Blasen extrudieren. D) Nach ~ 5 Tage (d) die Aggregate zu bilden beginnen . Die Aggregate abgetastet werden alle 7 Tage und bebildert mittels Lichtmikroskopie, um ihre Entwicklungs-Progression (20-facher Vergrößerung von 3-D-humanen epithelialen Zellen vaginal). E) überwachen Nach der Fertigstellung Aggregatbildung und zelluläre Differenzierung stattgefunden hat, werden die Aggregate aus dem Bioreaktor geerntet und übertragen in einem 50 ml konischen Röhrchen. F) Aggregate können in ein 1,5 ml Tube oder einem Multi-Well-Platte-Format für einen experimentellen Analysen und Assays ausgesät werden. G) Outline of pote ntial Assays und Analysen, die zu den Aggregaten durchgeführt werden kann. Diese repräsentative Liste der Analysen ist nicht dazu gedacht, ein vollständiger Katalog aller möglichen Downstream-Anwendungen sein.
Abbildung 2. Untersuchen morphologischen und strukturellen Eigenschaften der 3-D-epithelialen Zellaggregate mittels Elektronenmikroskopie. (A) Rasterelektronenmikroskopie (REM) Aufnahme eines 3-D-humanen epithelialen vaginalen Zellverbandes. Maßstabsbalken: 200 um (100x), 100 um (200x), 50 um (500x). Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Aufnahme eines 3-D-humanen epithelialen vaginalen Zellverbandes mit Pfeilen zu (B) intrazellulären Vesikeln und Mikrovilli oder (C) "zytoplasmatische Prozesse". Maßstabsbalken: 2 mu m (modifiziert nach Hjelm et al 2010.) 2.
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Abbildung 3. Konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie verwendet werden, um Grenzschichtepithel Differenzierung und Protein-Marker im 3-D-Epithelzellen Aggregate zu identifizieren. Human 3-D Vaginalzellen aus dem Bioreaktor nach 32 Tagen geerntet, fixiert und gefärbt mit (A) Mucin MUC1-Antikörper, (B) Antikörper, der für Epithelzellen, ESA, oder (C) Anti-Involucrin (INV) Antikörper, der ausdifferenzierten Epithelzellen erkennt. Aggregate wurden indirekt mit Alexa 488 Sekundär-Antikörper (grün) gekennzeichnet. Maßstab: 60 um (modifiziert nach Hjelm et al 2010.) 2.
Abbildung 4. MTT-Assay wird verwendet, um die Zelllebensfähigkeit zu messen. Human 3-D vaginalen Aggregate wurden in einer 24-Loch-Platte ausgesät und mit Medium allein (unbehandelt) und 0,01%, 0,1% oder 1,0% Triton X-100 Detergens für 1 h bei 37 ° C. Followin g Behandlung Medium wurde entfernt und die MTT-Assay wurde durchgeführt, um die Zelllebensfähigkeit zu messen. Stellt ** p <0,001; einseitigen Student-t-Test Vergleich von Triton X-100 behandelten Zellen zu unbehandelten Kontrolle.
Abbildung 5. Verwendung 3-D-epithelialen Zellverbände zu Bildschirm Verbindung Toxizität. (A) Nonoxynol-9 (N-9) dosisabhängig Lebensfähigkeit Kurve 24 h nach der Behandlung von 3-D menschlichen vaginalen Epithelzellen Modell (rote Linie / Balken) im Vergleich zu gleichen Zelltyp als konfluente Monolayer (schwarze Linie / Balken) gewachsen. (B) N-9 TC 50 Ebenen der vaginalen Epithel-Zellkulturen in (A) bei 1,5 h, 4 h, 8 h und 24 h nach der Behandlung. * Steht für p <0,05; einseitigen Student-t-Test Vergleich der Monoschichten auf 3-D-Zellen bei jeder Belichtungszeit. (Von Hjelm et al Modified. 2010) 2.
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Abbildung 6. Die Analyse der Zytokin-Produktion in 3-D-Epithelzellen als Reaktion auf Toll-like Rezeptor (TLR)-Agonist Stimulation. Drei-D menschlichen Vaginal-Zellen wurden mit FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), Wappen (TLR5) stimuliert und CL097 (TLR7 / 8) für 24 h und sezernierten Zytokine wurden von Cytometric Bead Array gemessen. IL-6 als ein repräsentativer proinflammatorische Cytokin hergestellt und gemessen wurde. * Steht für p <0,05; einseitigen Student-t-Test Vergleich der stimulierten Proben zu PBS-Gruppe. (Von Hjelm et al Modified. 2010) 2.
Abbildung 7. Monitoring der Genexpression in 3-D-Epithelzellen. Halbquantitative RT-PCR-Analyse von Progesteronrezeptor (PR)-Expression in Monoschicht (ML) oder 3-D-menschlichen vaginalen Epithelzellen. GAPDH als Ladekontrolle gezeigt. Amplifikationsproduktegezeigt, sind ein Ergebnis der Transkriptexpression, die nach 30 PCR-Zyklen. Pfeilspitzen weisen auf PR-Bands auftreten, nur in der 3-D-Probe.
8. Proteinexpression Analyse von 3-D Epithelzellen. Western-Blot-Analyse der Monoschicht und 3-D-menschlichen Vaginal Epithelzelle Ganzzelllysaten (30 &mgr;) sondiert mit einem Anti-Progesteron-Rezeptor (PR) antibody. β-Tubulin wurde als eine Sonde zum Laden Kontrolle verwendet.
Abbildung 9. Drei-D humanen epithelialen Zell-Modell unterstützt eine produktive virale Infektion. Konfokale Immunfluoreszenz Bild von 3-D menschlichen vaginalen Epithelzellen Aggregat mit HSV-2 infiziert. Die Zellen wurden bei einer MOI von 1,0 für zwei Stunden gewaschen, 24 h nach Infektion (4% PFA), infiziert und gefärbt mit einer HSV-2-spezifischen VP5 capsid Antikörper (grün) und die Kernfärbung DAPI (blau). Maßstab: 50 um.
Abbildung 10. Individuelle Zellanalyse in 3-D-Modell menschlicher Epithelzellen mittels Durchflusszytometrie. (A) Monoschicht oder (B) 3-D-menschlichen epithelialen vaginalen Aggregate wurden dissoziiert EDTA, markiert mit einem FITC-konjugierten MUC1-Antikörper (blau), einem Isotyp-Kontrolle (grün) oder PBS (rot) und FITC-Expression wurde durch quantifiziert Durchflusszytometrie. Zahlen stellen den Prozentsatz an Zellen, die positiv für Mucin-Antikörper, die nach Ausblendung Hintergrundfluoreszenz von den Isotyp-Kontrolle gefärbten Zellen blieben gefärbt. Non-Uniform Peaks sind ein Ergebnis der Vielzahl von Mustern glycosolation und unterschiedliche MUC1 auf der Oberfläche dieser Zellen.
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Discussion
Die Verwendung des RWV-Bioreaktor-Technologie kann hier präsentierten Forscher mit der Fähigkeit zu geben, ihre aktuelle Zellkultur-System zu einer physiologisch relevanten organotypischen Zellkultur-Modell voranzutreiben. Die RWV Bioreaktor Zellkultur-System liefert eine niedrige Scherung Mikroumgebung, die Zellen ermöglicht 3-D-zellulären Aggregaten mit in vivo-ähnlichen Eigenschaften, einschließlich Tight Junctions, Muzin-Produktion, extrazellulärer Prozesse (dh Mikrovilli) und zellulären Polarität bilden. Die Mehrzahl der Daten und hier vorgestellten Beispiele den vaginalen Epithelzellen in der RWV System entwickelt, jedoch die RWV System zur Kultur anderen epithelialen Zelltypen, einschließlich Dünndarm und Dickdarm, Lunge, Blase, der Leber, Mandeln und Epithelzellen verwendet zu 3-D-Modelle organotypischen 1, 7-13, 18 zu bilden. Darüber hinaus hat dieses System zur Kultur anderen Zelltypen als Epithelzellen verwendet, und zur Zeit der Entwicklung komplexer, multicellulären organotypischen Kultur Modelle sind im Gange 2, 18.
Die hier skizzierten Protokolle sollen als Anhaltspunkte dienen, und müssen unter Umständen auf der Grundlage der Zelltyp von Interesse geändert werden. Die häufigsten Änderungen des Protokolls zur Kultivierung von Epithelzellen in der RWV Systems umfassen die Länge der Zeit die Zellen in der STLV kultiviert werden, und den Zeitpunkt der Entscheidung Gesamtübertragungsrate der STLV der HARV, und die Zelle / Perle-Verhältnis für das erste Aussaat im STLV. Eine spezielle Modifikation, die für eine erfolgreiche Aggregatbildung als werden können, sind die Eigenschaften der Mikroträger Kügelchen oder Gerüst, wie Oberfläche, Durchmesser, Form, Oberflächenbeschichtungen, Dichte, Ladung, Kernmaterial und Porosität. Darüber hinaus kann eine Anpassung des Basis-Nährboden, der Formulierung, oder Ergänzungen, notwendig sein, die Kulturbedingungen optimieren, so dass Aggregatbildung. Einstellungen können auch in den Bioreaktor und seine Komponenten hergestellt werden, ineinschließlich der Größe des Gefässes und der Drehzahl. Für eine bessere Bewertung der Mikroumgebung im Bioreaktor ist ein perfundierten Kultursystem ebenfalls erhältlich, ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung des pH, Sauerstoff und der Blutglukose in dem Kulturgefäß gewährleisten eine fruchtbare Umgebung für Aggregatbildung. Die möglicherweise langen Zeit, Kulturbedingungen, Aggregatbildung, die zelluläre Differenzierung zu optimieren und jedes neue Modell-System, als auch den anfänglichen Kosten der Bioreaktor-System, zu charakterisieren sind bemerkenswert Nachteile dieses Systems. Jedoch wird jede neue Kultur-System in einem Labor durchgeführt haben ähnliche Nachteile.
Wir und andere haben gezeigt, dass RWV-abgeleiteten Modelle Nutzung menschlicher Zellen kann ein wertvolles Instrument für die Vorhersage der Wirksamkeit, Toxizität und Pharmakokinetik von Impfstoffen, Mikrobiziden, Biologika und Pharmazeutika in einer Weise, die für den Menschen relevant 1, 2, 18 ist. Mit dem Erfolg von thist Bioreaktorkultur System, um authentische menschliche Reaktionen zu produzieren, mit seiner Flexibilität kombiniert, werden die Anwendungen des RWV Bioreaktor-System derzeit auf solchen Gebieten wie Tumor-Modellierung, die regenerative Medizin und Tissue Engineering 2, 18-23 erweitert. Um unsere RWV-generated Schleimhaut-Modelle arbeiten wir an einer komplexeren vielzelligen System, das sowohl die Struktur und Funktion des menschlichen Schleimhaut Wiederholungen schaffen werden voranzutreiben. Allerdings sind sich die Autoren, dass kann es notwendig sein zu nutzen oder zu integrieren mehrere Modellsysteme, um die komplexen Interaktionen, dass Medikamente oder Impfstoffe haben mit der menschlichen physiologischen Systemen zu reproduzieren. Insgesamt ist unser Ziel, mit dem RWV Bioreaktor und seine experimentelle Anwendungen besser zu verstehen Schleimhautgewebe Biologie und die zellulären Reaktionen auf umweltbedingte Schädigungen im menschlichen organotypischen Modellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Brooke Hjelm für ihr technisches Know-how und Andrew Larsen danken für seine Protein-Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Alternativen Research Development Foundation (MMHK) Grant und der NIH NIAID Sexuell übertragbare Infektionen und topischer Mikrobizide Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK) gefördert. Wir danken Biology of Reproduction für die Wiederverwendung von Zahlen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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