Et roterende cellekultur, der tillader epitelceller til at vokse under fysiologiske betingelser, hvilket resulterer i 3-D cellulær aggregatdannelse er beskrevet. Aggregaterne dannes display<em> In vivo</em>-Lignende egenskaber, ikke er observeret i traditionelle kultur modeller og tjene som et mere præcist organotypiske modelsystem for en lang række videnskabelige undersøgelser.
Celler og væv i kroppen oplevelse miljømæssige forhold, der påvirker deres arkitektur, intercellulære kommunikation, og overordnede funktioner. Til in vitro cellekulturmodeller nøjagtigt at efterligne vævet af interesse, vækstmiljø af kulturen er et kritisk aspekt at overveje. Almindeligt anvendte konventionelle cellekultursystemer udbreder epitelceller på flade todimensionale (2D) uigennemtrængelige overflader. Selvom vi har lært meget fra konventionelle celledyrkningssystemer, mange fund er ikke reproduceres i humane kliniske undersøgelser eller vævseksplantater, muligvis som følge af manglen på en fysiologisk relevant mikromiljø.
Her beskriver vi en kultur, der overvinder mange af de dyrkningsbetingelse grænser 2-D cellekulturer ved hjælp af den innovative roterende væg beholder (RWV) bioreaktor teknologi. Vi og andre har vist, at organotypiske RWV-afledte modeller kan gentage struktue, funktion og autentiske menneskelige reaktioner på eksterne stimuli på samme måde til mennesker eksplantation væv 1-6. Den RWV bioreaktor er en suspensionskultur, der tillader vækst af epitelceller under lav fysiologisk væske forskydningsbetingelser. Bioreaktorerne kommer i to forskellige formater, en høj-aspekt roterende beholder (HARV) eller en langsom drejning lateral beholder (STLV), hvor de afviger fra deres beluftning kilde. Epitelceller tilsættes til bioreaktoren valg i kombination med porøse, collagen-overtrukne mikrobærerperler (figur 1A). Cellerne udnytte perlerne som en vækst stillads under konstant frie fald i bioreaktoren (fig. 1B). Mikromiljøet fra bioreaktoren tillader cellerne at danne tredimensionale (3D) aggregater viser in vivo-lignende karakteristika ofte ikke observeret under standard 2-D dyrkningsbetingelser (figur 1D). Disse egenskaber omfatter stramme vejkryds, MUCos produktion apikale / basal orientering in vivo protein lokalisering, og yderligere epitelcelle-typespecifikke egenskaber.
Progressionen fra et monolag af epitelceller til en fuldt differentieret 3-D aggregat varierer baseret på celletype 1, 7-13. Periodisk prøveudtagning fra bioreaktoren tillader overvågning af epitel aggregatdannelse, cellulære differentieringsmarkører og levedygtighed (figur 1D). Gang cellulær differentiering og aggregatdannelse er etableret, høstes cellerne fra bioreaktoren, og lignende assays udført på 2-D-celler kan anvendes til de 3-D aggregater med nogle aspekter (fig. 1E-G). I dette arbejde beskriver vi detaljerede trin hvordan kultur 3-D epitelcelletyper aggregater i RWV bioreaktoren og en række potentielle assays og analyser, der kan udføres med de 3-D aggregater. Disse analyser indbefatter, men er ikke begrænset til, strukturelle / morphological analyse (konfokal, scanning og transmissions elektron mikroskopi), cytokin / chemokinet sekretion og cellesignalering (cytometrisk perle array og Western blot-analyse), genekspression analyse (real-time PCR), toksikologiske / narkotika analyse og vært-patogen interaktioner. Anvendelsen af disse analyser lagt grunden til en mere dybdegående og omfattende undersøgelser, såsom metabolomics og transcriptomics, proteomics og andre array-baserede applikationer. Vores mål er at præsentere en ikke-konventionelle midler til dyrkning af humane epitelceller til at producere organotypiske 3-D modeller, der rekapitulerer den menneskelige in vivo væv, i en let og robust system, der skal bruges af forskere med forskellige videnskabelige interesser.
Udnyttelse af RWV bioreaktorteknologi præsenteret her kan give forskere mulighed for at fremme deres nuværende cellekultursystem til en mere fysiologisk relevant organotypisk cellekultur model. Den RWV Bioreaktoren cellekultursystem tilvejebringer en lav forskydning mikromiljø, der muliggør celler til dannelse af 3-D cellulære aggregater med in vivo-lignende egenskaber, herunder tight junctions og mucinproduktion og ekstracellulære processer (dvs. mikrovilli) og cellulære polaritet. Størstedele…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Brooke Hjelm for hendes teknisk ekspertise og Andrew Larsen for sin protein analyse. Dette arbejde blev finansieret delvist af Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant og NIH NIAID seksuelt overførte infektioner og aktuelt mikrobicider Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi takker for Biology of Reproduction for genbrug af tal.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
Coverslips | VWR | 48366067 | |
Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
DPBS | Gibco | 14190 | |
EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |