Summary
Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri dolaşıyor
Abstract
Anjiogenez, vaskülojenez ve arteriogenesis ile yeni kan damarları oluşumu uzun süredir kez son 1 gözden geçirilmiştir. Endotel progenitör hücreler (EPC) dolaşımdaki varlığı ilk Asahara ve arkadaşları tarafından yetişkin insan periferik kan tespit edilmiştir. 1997 2 vasküler yenilenme ve onarım için yeni hipotezler ve stratejilerin bir infüzyon getirmekte. EPC dolaşan kan nadir fakat normal bileşeni olduğu kan damarları oluşumu ya da vasküler yeniden şekillenme sitelerine ev ve hücreler 3 elde mevcut damar duvarının parakrin stimülasyon ile büyük ölçüde ya da doğum sonrası vaskülojenez, anjiyogenez veya arteriogenesis kolaylaştırmak. EPC tanımlamak için spesifik bir belirteç tespit ve alanın şu anda devlet proanjiyogenik hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri anlamak, anjiogenik hücreleri, Tie2 + monosit, miyeloid progenitör cel dolaşan edilmiştirLs, tümör ilişkili makrofajlar, M2 ve aktive makrofajlar klinik öncesi hayvan modeli sistemlerinin çeşitli hastalık durumları ve çok sayıda 4, 5 in insan denekler içinde anjiyojenik işlemi uyararak katılabilir. Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli, replating üzerine yeteneğini oluşturan ikincil ve üçüncül koloni ve bağışık yetmezliği olan farelere 6-8 içine nakli üzerine in vivo damarlarda intrinsik kurma yeteneği ile karakterize nadir dolaşan canlı endotel hücreleri vardır. ECFCs başarıyla sağlıklı erişkin birey, sağlıklı doğan bebeklerin göbek kordon kanı (CB), ve çok sayıda insan arteriyel ve venöz damarların 6-9 damar duvarının periferik kandan izole olmuş, CB ECFCs 7 en yüksek frekans sahip olduğu ekran en sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli ve in vivo 8, 10-13 form dayanıklı ve fonksiyonel kan damarları. Iken derivasyonErişkin periferik kandan ECFC burada derivasyon için yöntemler tarif, 14, 15 sunulmuştur, klonlama, genişleme, ve in vitro hem de insan umbilikal CB ECFCs in vivo karakterizasyonu gibi.
Protocol
Reaktifler ve Çözümleri
EMG-2 medya (Lonza, Kat. Cc-3162 EBM-2 bazal, orta ve EGM-2 SingleQuot kiti Takviyeler, ve büyüme faktörleri içeren)
EBM-2 (Lonza, Cat No. Cc-3156), tüm SingleQuot kiti takviyesi ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş (Lonza, Cat No. Cc-4176), 10% (v / v) sığır cenin serumu (FBS) ve 1% (v / v) penisilin (10.000 U / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml) / amfoterisin (25 ug / ml). 4 ° C de 1 ay kadar saklayabilirsiniz Sürece ECFC kültür için kullanılması önerilir EGM-2 cilt, 500 ul / kuyu 24-iyi plakalar, 2 ml / 6-iyi plakaları, 5ml/25-cm 2 matara, ve 10 ml/75-cm 2 matara içindir Aksi protokolü belirtilen.
Kollajen Ben çözüm
Steril damıtık su 495 ml (0.02 N son konsantrasyon) buzlu asetik asit (17.4N) ile 0,575 ml seyreltilir. 0.22-mikron süpürge ile Steril filtre seyreltik asetik asitUUM filtreleme sistemi. 50 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona seyreltik asetik asit, 25 mg, fare kuyruk kolajeni I ekleyin. Kollajen miktarı kollajen stoku konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir eklendi. 4 ° C de bir ay kadar saklayın
Kollajen I-kaplı doku kültür yüzey hazırlanması
6-sıra doku kültürü plakası (/ de 24-iyi plakaları, 3ml/25-cm 2 matara, ve 8 ml/75-cm 2 şişeler için 300 ul kullanın) her iyi kollajen I çözeltisi yerine 1 ml. 37 'de bir gece için 1 saat inkübe ° C. Kollajen Ben çözümü çıkartın ve PBS (6-iyi plakaları, 5ml/25-cm 2 matara, ve 10 ml/75 için ul / kuyu 24-iyi plakalar, 2 ml / 500 kullanan yüzey iki kez, her zaman yıkayın -cm 2 şişe). Hücre kültürleri için hemen tabak kullanın.
FACS boyama tamponu
Salin (PBS) 2% (v / v) sığır cenin serumu (FBS) eklenmiş fosfat tamponlu. Mağaza u4 az 2 hafta p ° C
A. ECFC akıbet, Klonlama ve Genişletme
- Oda sıcaklığında laboratuvara bir antikoagülan ve ulaşım gibi heparin (10 U heparin / ml kan) veya EDTA ile CB toplayın ve mononükleer hücre (MNC) izolasyonu için hemen (bebeğin teslim 2 saat içinde) sürecini örnek.
- Tablet 15 Her 50 ml konik santrifüj tüpüne CB ml ve karıştırmak için CB ve pipeti birkaç kez her tüp için PBS 20 ml ekleyin. 20 ml bir şırınganın içine 15 ml Ficoll-Paque hazırlayın ve 20G iğne veya karıştırma kanül takın. Seyreltilmiş kan tüpün altında karıştırma kanülün ucu yerleştirin ve dikkatli bir şekilde 15 ml Ficoll-Pague altlık. Yavaşlama fren ayar olmadan, oda sıcaklığında, 740 x g'de tüpler 30 dakika santrifüj edilir.
- Bir transfer pipet kullanarak, Ficoll-Paque ve nispi plazma arasındaki kesişme noktasında bulunan düşük yoğunluklu ÇUŞ'ların puslu katmanı kaldırın. 50 ml konik tüp devam içine ÇUŞ Dağıtma10 ml EGM-2 orta aining. Yüksek bir yavaşlama fren ayarı ile, oda sıcaklığında, 515 x g'de 10 dakika santrifüje ÇUŞ'lar.
- Dikkatlice aspire ve supernatant atın. Iki kez EGM-2 (515 xg'de 10 dk) ile pelet hücreleri yıkayın ve 1.25 x 10 7 hücre / ml EGM-2'de çok uluslu şirketler yeniden askıya. Kollajen hazırlayın 1 ml sıçan kuyruğu kollajen tip I (50 mg / ml) eklenerek başına iyi ve geceleme plaka kuluçkaya I kaplı 6-sıra doku kültürü tabak. Pipetle 4 her oyuğuna Bu MNC süspansiyon 37 ml ve hücreler yerleştirmek ° C'de,% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş. A.1.5) 24 saat sonra (1. gün), yavaş bir pipet yardımıyla kuyudan harcanan orta (gevşek yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin) çıkarın, yavaş yavaş iyi 4 ml EGM-2 ekleyin ve inkübatör için plaka dönüş . Gün 2, yenileme yavaş bir pipet yardımıyla kuyudan orta (gevşek yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin) kaldırılması ve 4 ml EGM-2, her kuyuya ekleyerek orta. Orta değişiklik günlük un tekrarlayınGün 7 ve her geçen gün til ECFC koloniler klonlama için görünür sonra kadar. Tipik olarak koloniler günde 5 ve gündüz 14 gün 7 (Şekil 1) arasında görünür.
- Inverted mikroskop kullanarak arnavut morfolojisi ile tipik ECFC koloniler gözünüzde canlandırın (10x büyütme) ve her koloninin konumunu belirtmek için de alt tarafında bir işaretleyici ile koloni sınırları işaretleyin.
- 14. günde, PBS ve klonlama silindir kullanılarak hasat bireysel koloniler ile bu birincil koloniler 2 kez yıkayın ve yeterli silindir içindeki hücreleri kapsayacak şekilde ifade TrypLE. PBS son yıkama aspire sonra, her koloni çevresinde steril jel kaplı klonlama silindir yerleştirin ve steril forseps kullanarak plaka karşı sıkıca bastırın. Silindir içindeki hücrelerin ayırmak alıncaya kadar 3-5 dakika, her klonlama silindir ve inkübe içine sıcak TrypLE ekspres 2-3 damla ekleyin. Silindirin merkezine yaklaşık 250 ul EGM-2 orta ekleyin ve g yukarı ve aşağı pipetlemetek bir hücre süspansiyonu enerate. Tek bir mikro-santrifüj tüpüne ayrı ayrı klonlama tüpten tek hücre süspansiyonu aktarın.
- Kalan tüm hücreleri toplamak ve ilgili mikro-santrifüj tüpüne her silindir gelen yıkama aktarmak için yaklaşık 250 ul EGM-2 orta silindirin içinde 2-3 kez yıkayın. 5 dakika santrifüj masa üzerinde yüksek hızda (≤ 300 xg) olarak hücreleri santrifüjleyin.
- 1.5 ml taze EGM-2 orta süpernatantı ve yeniden askıya hücre pelletini. 500 uL sıçan-kuyruk kolajeni I (50 ug / ml) ile önceden kaplanmış bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası ve her birinin içine tüpten hücre süspansiyonu (bireysel koloniler bütün hücre içeren) aktarılır.
- Medya ile genişleme için inkübatör içindeki yeri her geçen gün yapılan değişir.
- Hücrelerin% 80-90 konfluense yaklaştığınızda, PBS ile hücreleri yıkayın daha sonra 2 kez harcanan aracı kaldırmak ve her kuyuya 500 mikrolitre TrypLE ekspres orta ekleyin24-kuyucuklu doku kültürü plakası. Hücreler kadar yuvarlak ve ayırmak alıncaya kadar 3-5 dakika süreyle inkübatör içinde plakası yerleştirin. Yıkama ile hücreleri toplamak ve 15 ml tüp aktarmak için her kuyuya EGM-2 1 ml (% 10 FBS tanımlanmış olarak) ekleyin. Kalan tüm hücreleri toplamak ve ilgili 15 ml tüp içine her kuyudan yıkama aktarmak için 1 ml EGM-2 orta ile iyi yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri.
- 1 ml taze EGM-2 orta (% 10 tanımlanan FBS ile) orta çıkarın ve yeniden askıya hücre pelletini. Bir hemasitometre ve tripan mavi dışlama kullanarak Tümbölenin canlı hücre sayısını edinin.
- Hücrelerin tekrar alt-kültüre önce konfluense% 80-90 yaklaşmak kadar medyada her gün değiştirmek ile EGM-2 medya Ben önceden kaplanmış doku kültürü yüzeyler kollajen üzerine yaklaşık 5000 hücre / cm 2 tohumlayarak hücreleri genişletin.
ECFCs in vitro Fenotipik Karakterizasyonu B.: Endotel Hücre Yüzey Antijen İfade birklonal Proliferatif Potansiyel d Tek Hücre Testi
- Endotel hücre yüzey antijeni ifadesi için, ECFC klonlama ve genişleme için açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile hücreleri ayırmak.
- FACS boyama tamponu yeniden askıya hücreler (10 X 10 6 hücre / tampon boyama 1ml FACS) sonra FCR engelleme reaktifi (20 ul / 10 X 10 6 hücre) ekleyin, 10 dakika süreyle buz üzerinde nazikçe ve yerde karıştırın.
- Her bir endotel yüzey antijeni ve izotip kontrolleri için mikro-santrifüj tüpündeki bu hücre süspansiyonu kısım 100 ul. . 1 X 10 6 hücre: endotel antijenleri (CD31, CD144, CD146 ve CD105) veya hematopoetik antijenleri (CD45, ve CD14) tanımak ve ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde terk florokrom etiketli insan monoklonal antikorlar uygun miktarda Dikkat ekle her bir test için gerekli değildir. Yazarlar genellikle 10 4 analiz 2 X elde etmek için 0.5 ile 1 X 10 5 hücre / tüp hazırlamakd olaylar. Ayrıca, her bir test için kullanılacak antikor miktarını için Üreticiler tavsiyesini izleyin. Bazı antikorlar uygun antikorun konsantrasyonunu belirlemek için titre gerektirebilir. Yazarlar gerçekleştirdiğinizi Tüm boyama tek renkli boyama vardır.
- Buz üzerinde 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 dakika süre ile, bir tezgah üstü santrifüj üzerinde yüksek hızda santrifüj tüpünün her biri daha sonra süpernatan kaldırmak ve FACS tampon içinde tekrar askıya hücre peleti.
- Her bir antijen için olumlu veya olumsuz leke hücrelerin yüzdesi belirlemek için bir akış sitometresinde örnekleri analiz edin. ECFCs CD31, CD144 ve CD146 için eşit pozitif leke, ancak CD45 ve CD14 negatif ilgili izotip kontrollere göre.
- Klonal bir proliferatif potansiyelini incelemek için tek bir hücre deneyi için, ECFC klonlama ve genişlemesi için tanımlanmış benzer yöntemler kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile erken geçişi (2-3) hücreleri ayırır.
- Bu hücreleri enfektegelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) Lentivirüs 16 ifade ve floresan sitometri ile EGFP ifade hücreleri toplamak Dikkat:. lentivirüs çalışma ise çeker ve tüm biyo-güvenlik önlemlerine uyulmalıdır kabul edilir.
- Kültür onları ECFC genişleme bölümünde kültür ECFC için nitelendirdi.
- 50 ul sıçan kuyruğu kollajen tip I (50 mcg / ml) başına da ekleyerek Kolajen I kaplı 96-tabak hazırlayın ve geceleme plaka inkübe. TrypLE ifade kullanarak EGFP + ECFCs toplayın ve son konsantrasyonu ~ 10 6 hücre / ml ile EGM-2 orta onları tekrar süspansiyon.
- Tek EGFP + ECFC başına iyi bir 96-plaka sıralamak ve EGM-2 ile başına iyi 200 ul nihai ses seviyesini ayarlamak için 20 hücre / saniyenin düşük debi ile FACS Vantage (Becton Dickson) veya diğer benzer sıralayıcı kullanın. Her iyi yalnızca bir hücre aldığınızdan emin olmak için ters bir floresan mikroskop kullanın. Alternatively, tek hücre FSC ve SSC ve koloniler hücre puanlama ve miktar tayini için kullanılan boyama Sytox nükleer boya göre sıralanabilir.
- 5. gün ve 10. günde yapılan iki ortam değişiklikleri (200 ul EGM-2 ile çok kanallı pipetter) ile iki haftalık bir süre içinde plaka inkübe edin. Kültür 14. günde, 30 dakika için% 4 paraformaldehit 100 ul sahip hücrelerin sabitleme önce 100 ul PBS ile birlikte, her sıra yıkanır. EGFP ifade değildir ECFCs için, 4 ° C'da paraformaldehit fiksasyon ve inkübe ardından Sytox reaktifi, yeşil floresan nükleer boya ekleyin.
- 14 gün kültüre tek bir hücreden genişletilmiş endotel hücrelerinin sayısı ölçmek için, her sıra incelemek için flöresanlı bir mikroskop kullanabilir. Kantitatif analiz için, skoru pozitif olarak 2 veya daha fazla endotel hücreleri (silahlanma) ile kuyu ve floresan mikroskop ile görsel sayım toplam endotel hücre sayımı için onları biraz daha inceleyin.
- T görüntülemek için2, 50, 51-2000, ve 2001 veya daha fazla olarak kabul edilir: O bir endotel hücre sayısı ile veri, kuyular elde edilen endotel hücre kümeleri, düşük proliferatif potansiyel (LPP)-ECFCs ve yüksek proliferatif potansiyel (HES) - sırasıyla ECFCs. ECFCs 14 gün boyunca tek bir hücre düzeyinde kültüre zaman endotel kümeleri, LPPS ve hidroelektrik santrallerde yol vererek klonal bir proliferatif potansiyeli tam hiyerarşisi sergilerler. 7
In vivo Gemi Oluşumu deneyi vaskülojenez için ECFC Potansiyeli inceleyin: ECFCs in vivo Fonksiyonel Karakterizasyonu C.
- FBS (10: 1 ml jel (ki daha sonra 2 implantlar oluşturmak üzere ikiye edilecektir) döküm için gerekli Aşağıdaki jel malzeme her birinin toplam hacmi (ml) (parantez içinde nihai konsantrasyon) ile hesaplayarak cellularized jel implantlar hazırlamak %), 2-EBM 10:01 (1 ml nihai hacme ayarlamak), sodyum bikarbonat (1.5 mg / ml), NaOH (7.4 pH ayarlama), HEPES (25 mM), fibronectin (100 ug / ml) ve kollajen I (1.5 mg / ml).
- Jel malzeme hesaplama sonra, ECFC klonlama ve genişlemesi için tanımlanmış benzer yöntemler kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile hücreleri ayırmak. Bir hemasitometre ve tripan mavi kullanarak bir kısım bir canlı hücre sayısını edinin. Bir 50 ml-konik bir tüp ve pellet 515 x g, oda sıcaklığında, santrifüj yoluyla hücre içine 2.400.000 yaşayabilir hücrelerin transfer edin. Aynı zamanda, bir buz 50 ml konik tüp (listelendikleri aynı sırayla) hesaplanan HEPES hacimleri, sodyum bikarbonat, EBM-2 10:1, FBS, fibronektin ve kollajen ekleyerek jel matris solüsyon hazırlanır. İyice karıştırın ve buz üzerinde çözüm tutarken NaOH ile 7.4 'e pH ayarlayın.
- Santrifüjlemeden sonra hücreler arası Süpernatant atılır ve 360 ul sıcak EGM-2 içinde tekrar askıya pelet ve buna pH jel implant 1 ml nihai hacme verme, jel matris solüsyon 840 ul ayarlanabilir eklemek. Kadar yavaş yavaş jel matris çözüm içine hücreleri karıştırınhücreleri iyice jeli çözeltisi içinde süspanse edilmektedir.
- 12 iyi doku kültürü plakası ve 20-30 dakika süreyle inkübe jel polimerize kadar iyi biri bu 1 ml cellularized jel süspansiyon aktarın. Yavaşça 2 ml ılık EGM-2 ile jel kapağı ve bir gece inkübe edin.
- Hemen implantasyon öncesi, iris makası kullanarak iki eşit parçaya gecede İnkübe jel ikiye ayırmak ve iyi EGM-2 içeren ortamda aynı kültüre jel adet döner.
- Izoflurandan idare tarafından (5-6 haftalık NOD / SCID farelerinde) oturaklı hayvana hayvan cerrahi tesisi kullanın. Karnın alt kısmı Tıraş ve iyice alkol pedleri ve betadin veya diğer antiseptik ile cerrahi alan temizleyin. Sonra IACUC ve kurumsal düzenlemeler uyarınca perdeler alanı izole.
- Deri ve karın kas arasındaki subkutan boşluk açığa karın alt kadranda yaklaşık 5 mm kesi yapmak için steril keskin iris makası kullanarak. Üst kadranda içine üstün giden 15-20 mm genişliğinde cep oluşturmak için karın kas deri katmanı sayesinde küt diseksiyon gerçekleştirin. Aynı fare karnın başka bir tarafı da benzer açık cep oluşturmak için benzer işlemi tekrarlayın.
- Insizyon sadece kaudal dermal tabaka kaldırarak karın cebinden başka bir tarafı içine bir yarısı karın cebinden bir tarafı haline jel parçası ve jel bir yarım parça takın.
- Jellerin yerleştirildikten sonra, bir kesim iğne 5-0 polipropilen sütür ile 2-3 dikiş ile her kesi kapatın. Uygun kafes kartları etiketlemek ve kurumsal ve protokol ihtiyaçlarına göre ameliyat sonrası izleme ve analjezi gerçekleştirmek ve bu implante jel hücreleri için 14 gün de novo damar oluşturmasını sağlar.
- Son olarak, jel implantları hasadı genellikle fare euthanizing 14 gün sonra implantasyon sonra gerçekleştirilir.
- Swab karın alkol ped ile alanı veorijinal kesi hattı kaudal karın cildi kesilir. Dikkatle, jel olası konum cilt kaudal bir flep eksize tarafından implantı incelemek. Sonra jel çevresinde çevresel çinko sabitleştirici yer (BD Biosciences, en iyi sonuçlar için üretici firmanın tavsiye izleyin) kesme ve oda sıcaklığında 1-2 saat düzeltmek için izin ile Özel Tüketim implant.
- Histokimyasal standart protokolleri kullanarak parafine gömülü jeller hazırlayın ve hematoksilen ve eosin, jel içinde damarlarda görselleştirmek için anti-insan CD31 ya da anti-fare CD31 ile boyama gerçekleştirmek için cam slaytlar üzerinde 5 mm kesitler hazırlamak. ECFCs humanize gemileri üretmek için de novo vaskülojenez tabi cellularized jel implantlar 14 gün 4,8,11 için immün farelere içine yerleştirilir.
D. Örnek Sonuçlar
Birincil koloni formun bu ECFC türetme tekniği kullanarak Gözlemlediğimiz dışı büyüme5. gün (Şekil 1) gibi erken ation. Dışarı-büyüme ECFC koloniler tipik arnavut görünüm sergilendi ve klonlama tarafından koloni alma sonrası uzun dönemde genişlemesi üzerine,> 40 nüfus çiftlenmeler doğurdu. Genişletilmiş koloniler endotelyal antijenleri ifade, ama (Şekil 2) hematopoetik antijenleri ifade vermedi. Önemlisi, bir tek hücre düzeyinde (Şekil 3) klonal bir proliferatif potansiyeli tam bir hiyerarşisi görüntülenir. Dahası, ECFCs immün fareler 4, 6, 8, 11 (Şekil 4) içine yerleştirildi zaman ana eritrositler ile perfüze edilmiştir hümanize kan damarlarının oluşmuştur.
Şekil 1.. Endotel koloninin kordon kanı ve akıbet gelen mononükleer hücrelerinin izolasyonu (ÇUŞ) kordon kanı hücrelerinin Ficoll-Pague yoğunluk gradiyenti ayrılması sırasında kültürlü ÇUŞ. ÇUŞ formu buffy tabaka tabaka hücreleri (ECFCs) oluşturan. Sıçan kuyruğu kollajen kültür üzerindeki çok uluslu şirketler için buffy coat tabakasının Yalnızlık 5 ila 14 gün içinde ECFC koloninin akıbet kaplamalı plakalar sonuçları. Outgrowth ECFC koloni (ok başları ile gösterilir) arnavut morfolojisi 7 görüntülenir.
Şekil 2. Endotelyal ve hematopoetik hücre yüzey antijeni ifade vitro Temsilcisi fenotipik değerlendirmesi. Immünofeotipleme kordon kanından alınan ECFCs arasında ECFCs endotelyal antijenleri CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, FLK-1, Flt-4 ve NRP2 ifade ama ortaya hematopoetik antijenler CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 veya AC133 7, 8 ifade vermedi.
Şekil 3. Clonogenic ve CB elde ECFCs proliferatif potansiyel in vitro ölçümde Temsilcisi. (A) kordon kanıKaynaklı ECFCs> 2001 koloniler kadar 2-50 hücre kümeleri arasında değişen koloniler bir hiyerarşi ile klonal bir proliferatif potansiyeli gösterilecek. (B) koloniler (koloniler Sytox, daha kaliteli fotoğraf çekmek için yeşil floresan nükleer boya ile boyandı) hiyerarşisi Mikrografikleridir sonra elde edilen kordon kanı kaynaklı ECFCs 14 gün boyunca bir tek hücre düzeyinde kültüre edildi. Ölçek çubuğu 100μm 7, 8 temsil eder.
Şekil 4. Kordon kanından alınan ECFCs in vivo fonksiyonel karakterizasyonu Temsilcisi. Kord A) H & E boyama kan kaynaklı cellularized jel implantları içeren ECFC mikrodamar (ana eritrositler ile dolu) implantasyonu 14 gün sonra kolajen-fibronektin jel oluşumu göstermiştir. B) Anti-insan CD31 boyama (kahverengi leke) daha bu gemilerin insan kaynaklı onaylar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotelyal progenitör hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu klonal ve seri olarak yeniden kaplama kültüründe yeteneğine sahip iyi niyetli ECFCs belirlemek ve in vivo olarak dayanıklı ve fonksiyonel implante kan damarlarının neden önemlidir. İnsan göbek kordon kanı ECFCs ve yaşlanma veya hastalık 10 ile bu dolaşımdaki hücrelerin düşüşler konsantrasyonu ile zenginleştirilmiştir. Son çalışmalar ECFC damar yaralanması, miyokard enfarktüsü veya retinopati 17-19 durumlarda vasküler onarım veya yenileme önemli rol oynadığını düşündürmektedir.
Burada, derivasyon için basit ve etkili yöntemleri tarif var, klonlama, genişleme, ve in vitro, hem de insan umbilikal CB ECFCs in vivo karakterizasyonu gibi. Bu yaklaşımlar araştırmacılar klonal bir proliferatif potansiyeli ve sahip CB iyi niyetli EPC belirlemek ve izole sağlar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Dr Yoder EndGenitor Technologies, Inc için danışman ve Rimedion Technologies, Inc yönetim kurulu üyesidir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
