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Biology

Endothelial कॉलोनी सेल बनाने के प्ररूपी और कार्यात्मक विशेषता मानव नाल गर्भनाल रक्त से व्युत्पन्न

Published: April 13, 2012 doi: 10.3791/3872
Automatic Translation
1, 1, 1
1Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine

Summary

Endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) मजबूत clonal proliferative संभावित endothelial कोशिकाओं के साथ घूम रहे हैं कि आंतरिक दिखते

Abstract

Angiogenesis, vasculogenesis, और arteriogenesis के माध्यम से नए रक्त वाहिनियों के गठन का पुराना विचार हाल ही में किया गया है 1 समीक्षा. endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) परिसंचारी की उपस्थिति पहले Asahara एट अल द्वारा किए गए वयस्क मानव परिधीय रक्त में पहचान की. 1997 2 संवहनी उत्थान और मरम्मत के लिए नई परिकल्पना और रणनीतियों का एक जलसेक लाने में. निर्यात संवर्धन परिषदों खून परिसंचारी के दुर्लभ लेकिन सामान्य घटक है कि रक्त वाहिनियों के गठन या संवहनी remodeling के साइटों के लिए घर है, और या तो प्रसव के बाद vasculogenesis, angiogenesis, या arteriogenesis मौजूदा पोत 3 कोशिकाओं व्युत्पन्न दीवार के पैराक्राइन उत्तेजना के माध्यम से बड़े पैमाने पर की सुविधा. कोई विशिष्ट एक ईपीसी पहचान के मार्कर की पहचान की गई है, और वर्तमान में इस क्षेत्र की राज्य सहित proangiogenic hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि कई सेल प्रकार को समझने की है, angiogenic कोशिकाओं, Tie2 + monocytes, माइलॉयड पूर्वपुस्र्ष सेल परिसंचारीरास, ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज, और M2 मैक्रोफेज सक्रिय preclinical पशु मॉडल प्रणाली की एक किस्म में और कई रोग 4 राज्यों, 5 में मानव विषयों में angiogenic प्रक्रिया उत्तेजक में भाग लेते हैं. Endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) दुर्लभ परिसंचारी व्यवहार्य endothelial कोशिकाओं को मजबूत clonal proliferative संभावित, द्वितीयक और तृतीयक replating पर क्षमता बनाने कॉलोनी, और प्रत्यारोपण पर vivo वाहिकाओं में immunodeficient 6-8 चूहों में आंतरिक फार्म की क्षमता की विशेषता हैं. जबकि ECFCs सफलतापूर्वक स्वस्थ वयस्क विषयों, स्वस्थ नवजात शिशुओं की नाल गर्भनाल रक्त (सीबी), और कई मानव धमनी और शिरापरक 6-9 वाहिकाओं के पोत दीवार के परिधीय रक्त से अलग किया गया है, सीबी 7 ECFCs की सर्वोच्च आवृत्ति के पास है कि प्रदर्शन सबसे मजबूत clonal proliferative संभावित और vivo में 8, 10-13 में टिकाऊ और कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं फार्म. जबकि की व्युत्पत्तिवयस्क परिधीय रक्त से ECFC 15 14, प्रस्तुत किया गया है, यहाँ हम व्युत्पत्ति के लिए तरीके का वर्णन है, क्लोनिंग, विस्तार, और के रूप में मानव नाल की सीबी से ECFCs के vivo लक्षण वर्णन के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो.

Protocol

अभिकर्मकों और समाधान

EMG-2 मीडिया (LONZA, बिल्ली नहीं सीसी 3162 EBM-2 बेसल मध्यम और ईजीएम - 2 SingleQuot किट की आपूर्ति करता है, और वृद्धि कारकों से युक्त)

EBM-2 (LONZA, बिल्ली. नहीं सीसी 3156) पूरे SingleQuot किट की आपूर्ति करता है और वृद्धि कारकों के साथ पूरक (LONZA, बिल्ली. सीसी 4176 सं), 10% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% (v / v) (10,000 यू / मिलीलीटर) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 / μg मिलीलीटर) / amphotericin (25 μg / एमएल). 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर की सिफारिश की ईजीएम 2 ECFC संस्कृति के लिए उपयोग संस्करणों μl / 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 500, 2 मिलीग्राम / 6 अच्छी तरह प्लेटें, 5ml/25-cm 2 बोतल, और 10 ml/75-cm 2 बोतल के लिए कर रहे हैं, जब तक अन्यथा प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट है.

कोलेजन मैं समाधान

बाँझ आसुत पानी की 495 मिलीलीटर (0.02 एन अंतिम एकाग्रता) में हिमनदों एसिटिक एसिड (17.4N) 0.575 मिलीग्राम पतला. बाँझ फिल्टर 0.22 - माइक्रोन Vac के साथ पतला एसिटिक एसिडuum निस्पंदन प्रणाली. पतला एसिटिक एसिड के लिए 50 / μg एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए 25 मिलीग्राम चूहे की पूंछ कोलेजन मैं जोड़ें. कोलेजन की राशि जोड़ा कोलेजन स्टॉक एकाग्रता पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

कोलेजन मैं लेपित ऊतक संस्कृति सतहों की तैयारी

कोलेजन मैं 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति प्लेट (300/24 ​​अच्छी तरह प्लेटें, 3ml/25-cm 2 बोतल, और 8 ml/75-cm 2 बोतल के लिए अच्छी तरह से μl उपयोग) के प्रत्येक अच्छी तरह से में समाधान की जगह 1 मिलीग्राम. 37 पर रात भर के लिए 1 घंटे सेते हैं डिग्री सेल्सियस कोलेजन मैं समाधान निकालें और सतह पीबीएस (μl / 24 अच्छी तरह प्लेटें, 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह के लिए अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें, 5ml/25-cm 2 बोतल, और ml/75 10 के लिए 500 का उपयोग के साथ दो बार, हर बार धोने 2 बोतल - सेमी). सेल संस्कृतियों के लिए प्लेटें तुरंत का उपयोग करें.

FACS धुंधला बफर

फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) 2 (v / v)% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक. स्टोर यू4 में 2 सप्ताह के लिए पी डिग्री सेल्सियस

ए ECFC परिणाम क्लोनिंग, और विस्तार

  1. सीबी (10 यू हेपरिन / एमएल रक्त) हेपरिन या EDTA के साथ एक anticoagulant और कमरे के तापमान पर प्रयोगशाला के लिए परिवहन के रूप में और तुरंत mononuclear (एमएनसी) सेल अलगाव के लिए (शिशु प्रसव के 2 घंटे के भीतर) नमूना प्रक्रिया लीजिए.
  2. प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 15 अशेष भाजक सीबी मिलीग्राम और सीबी और विंदुक कई बार मिश्रण के प्रत्येक ट्यूब में पीबीएस की 20 मिलीलीटर जोड़ें. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में 15 मिलीलीटर Ficoll - Paque ड्रा और एक 20G सुई या मिश्रण प्रवेशनी देते हैं. पतला रक्त की ट्यूब के नीचे मिश्रण प्रवेशनी की टिप प्लेस और ध्यान से 15 मिलीलीटर Ficoll Pague बुनियाद. ट्यूबों 30 मिनट 740 XG अपकेंद्रित्र, कमरे के तापमान पर मंदी का ब्रेक की स्थापना के बिना,.
  3. एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, कम घनत्व बहुराष्ट्रीय कंपनियों के धुंधला परत Ficoll - Paque पतला और प्लाज्मा के बीच इंटरफेस पर स्थित हटा दें. एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब cont में बहुराष्ट्रीय कंपनियों के बग़ैर10 मिलीलीटर ईजीएम - 2 मध्यम aining. 515 XG में बहुराष्ट्रीय कंपनियों के 10 मिनट अपकेंद्रित्र, कमरे के तापमान पर एक उच्च मंदी ब्रेक की स्थापना के साथ,.
  4. ध्यान से महाप्राण (व्यंजन) और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. दो बार ईजीएम 2 (515 XG पर 10 मिनट) के साथ pelleted कोशिकाओं धो और ईजीएम-2 में 1.25 x 10 7 कोशिकाओं मिलीग्राम / बहुराष्ट्रीय कंपनियों के फिर से निलंबित. कोलेजन तैयार मैं लेपित 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें 1 मिलीग्राम चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार मैं (50 / μg मिलीलीटर) जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से और प्लेट रातोंरात incubating के द्वारा. विंदुक प्रत्येक अच्छी तरह से में इस बहुराष्ट्रीय कंपनी के निलंबन की 4 मिलीग्राम और 37 में कोशिकाओं की जगह डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर. A.1.5) (1 दिन) के 24 घंटे के बाद, धीरे धीरे अच्छी तरह से एक विंदुक के साथ खर्च मध्यम (शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को परेशान नहीं) को हटाने, धीरे धीरे अच्छी तरह से 4 मिलीग्राम ईजीएम-2 जोड़ने के लिए, और इनक्यूबेटर की थाली वापस . 2 दिन, ताज़ा धीरे धीरे एक विंदुक के साथ अच्छी तरह से मध्यम (शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को परेशान नहीं) को हटाने और 4 मिलीग्राम ईजीएम 2 प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के द्वारा मध्यम. दोहराएँ मध्यम परिवर्तन दैनिक संयुक्त राष्ट्र7 दिन और हर दूसरे दिन टिल उसके बाद जब तक ECFC कालोनियों क्लोनिंग के लिए दिखाई देते हैं. आमतौर पर कालोनियों 5 दिन और दिन के 14 दिन 7 (1 छवि) के बीच दिखाई देते हैं.
  5. Cobblestone आकारिकी के साथ ठेठ ECFC कालोनियों उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए कल्पना (10x बढ़ाई) और अच्छी तरह से नीचे पर एक मार्कर के साथ कॉलोनी सीमाओं को चिह्नित करने के लिए प्रत्येक कॉलोनी की स्थिति का संकेत है.
  6. 14 दिन पर, इन प्राथमिक कालोनियों पीबीएस और फसल व्यक्ति क्लोनिंग सिलेंडर का उपयोग कर कालोनियों के साथ 2 बार धोने और सिर्फ पर्याप्त व्यक्त TrypLE सिलेंडर के अंदर कोशिकाओं को कवर करने के लिए. पीबीएस की अंतिम धोने aspirating के बाद, प्रत्येक कालोनी के चारों ओर एक बाँझ जेल लेपित क्लोनिंग सिलेंडर जगह और बाँझ संदंश का उपयोग कर थाली के खिलाफ दृढ़ता से दबाएँ. प्रत्येक क्लोनिंग और 3-5 मिनट के लिए सिलेंडर सेते हैं में गर्म TrypLE व्यक्त की 2-3 बूँदें जोड़ें जब तक सिलेंडर के भीतर कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू. सिलेंडर के केंद्र में लगभग 250 μl ईजीएम 2 मध्यम जोड़ें और ऊपर और नीचे जी विंदुकएकल सेल निलंबन enerate के. प्रत्येक क्लोनिंग सिलेंडर से एकल कक्ष निलंबन अलग स्थानांतरण, एक व्यक्ति सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में.
  7. सिलेंडर 2-3 बार के भीतर लगभग 250 μl ईजीएम 2 से सभी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और प्रत्येक सिलेंडर से संबंधित सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में धोने के हस्तांतरण के माध्यम से क्षेत्र को धो लें. Tabletop अपकेंद्रित्र पर 5 मिनट के लिए उच्च गति (≤ 300 XG) में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  8. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1.5 मिलीग्राम ताजा मध्यम ईजीएम-2 में फिर से निलंबित सेल गोली. प्रत्येक ट्यूब से 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति पूर्व 500 μL चूहा पूंछ कोलेजन मैं (50 / μg मिलीलीटर) के साथ लेपित थाली का अच्छी तरह से एक में सेल निलंबन (व्यक्तिगत कालोनियों से सभी कोशिकाओं से युक्त) स्थानांतरण.
  9. इनक्यूबेटर अंदर मीडिया के साथ विस्तार के लिए जगह हर दूसरे दिन प्रदर्शन बदल जाते हैं.
  10. जब कोशिकाओं को 80-90% confluency दृष्टिकोण, खर्च मध्यम तो हटा धोने कोशिकाओं पीबीएस के साथ 2 बार और एक अच्छी तरह से 500 μl TrypLE व्यक्त मध्यम जोड़ें24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के. इनक्यूबेटर अंदर 3-5 मिनट के लिए थाली तक कोशिकाओं दौर और अलग लगते रखें. ईजीएम-2 के 1 मिलीग्राम (10% FBS परिभाषित) जोड़ें एक अच्छी तरह से धोने से कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण. 1 मिलीलीटर ईजीएम 2 करने के लिए सभी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा और संबंधित 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक अच्छी तरह से धोने के हस्तांतरण के माध्यम से अच्छी तरह धो लें. 5 मिनट के लिए 300 XG कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  11. मध्यम निकालें और 1 मिलीलीटर ताजा मध्यम ईजीएम 2 (10% परिभाषित FBS के साथ) में फिर से निलंबित सेल गोली. अशेष भाजक के एक hemacytometer और trypan नीला बहिष्कार का उपयोग व्यवहार्य सेल गिनती प्राप्त करते हैं.
  12. मीडिया हर दूसरे दिन बदलने के साथ एक कोलेजन मैं ईजीएम 2 - मीडिया में पूर्व - लेपित ऊतक संस्कृति सतहों पर कोशिकाओं के बारे में 5000/2 सेमी के बीज बोने की क्रिया द्वारा कोशिकाओं का विस्तार करें जब तक कोशिकाओं 80-90 confluency% उप - संवर्धन से पहले फिर दृष्टिकोण.

बी: इन विट्रो ECFCs प्ररूपी विशेषता Endothelial सेल सतह एंटीजन अभिव्यक्तिलिए clonal proliferative संभावित घ एकल सेल परख

  1. Endothelial कोशिका की सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति के लिए, TrypLE एक्सप्रेस के साथ कोशिकाओं को अलग करने के लिए ECFC क्लोनिंग और विस्तार के लिए वर्णित विधियों का उपयोग करके कोशिकाओं को इकट्ठा.
  2. FACS धुंधला बफर में पुनः निलंबित कोशिकाओं (10 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 1ml बफर धुंधला FACS) तो FCR अवरुद्ध अभिकर्मक (20 μl / 10 एक्स 10 6 कोशिकाओं) जोड़ने के लिए, बर्फ पर धीरे जगह और 10 मिनट के लिए मिश्रण.
  3. अशेष भाजक प्रत्येक endothelial सतह प्रतिजन और निर्धारण नियंत्रण के लिए सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में इस सेल निलंबन के 100 μl. 1 10 एक्स 6 कोशिकाओं: fluorochrome लेबल मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि endothelial (CD31, CD144, CD146, और CD105) प्रतिजनों या hematopoietic एंटीजन (CD45, और CD14) को समझते हैं और बर्फ पर प्रकाश से 30 संरक्षित मिनट के लिए छोड़ उचित राशि सावधानी जोड़ें प्रत्येक परीक्षण के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं. लेखकों को आम तौर पर 0.5 से 1 10 एक्स 5 कोशिकाओं / ट्यूब तैयार करने के लिए 2 एक्स 4 10 विश्लेषण प्राप्तघ घटनाओं. इसके अलावा, प्रत्येक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा एंटीबॉडी की राशि के लिए निर्माता की सिफारिश का पालन करें. कुछ एंटीबॉडी लिए इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता निर्धारित titrating की आवश्यकता हो सकती है. सभी धुंधला है कि लेखकों को प्रदर्शन किया है एकल रंग धुंधला कर रहे हैं.
  4. बर्फ पर ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, उच्च गति पर 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर प्रत्येक ट्यूब अपकेंद्रित्र फिर सतह पर तैरनेवाला को हटाने और फिर से निलंबित FACS बफर में सेल गोली.
  5. एक प्रवाह cytometer पर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित है कि प्रत्येक प्रतिजन के लिए सकारात्मक या नकारात्मक दाग. ECFCs CD31, CD144, और CD146 के लिए समान रूप से सकारात्मक दाग, लेकिन CD45 और CD14 के लिए नकारात्मक इसी निर्धारण को नियंत्रित करने के लिए तुलना में.
  6. एकल कोशिका clonal proliferative क्षमता की जांच परख के लिए, TrypLE एक्सप्रेस के साथ जल्दी (2-3) बीतने कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने है कि ECFC क्लोनिंग और विस्तार के लिए वर्णित किया गया था इसी तरह के तरीकों का उपयोग कर.
  7. इन कोशिकाओं को संक्रमितबढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ 16 lentiviruses व्यक्त और प्रतिदीप्ति cytometry द्वारा EGFP व्यक्त कोशिकाओं को इकट्ठा चेतावनी: lentivirus के साथ कार्य करना एक biohazard और सभी जैव - सुरक्षा सावधानियों का पालन किया जाना चाहिए माना जाता है.
  8. संस्कृति के रूप में उन्हें ECFC विस्तार के लिए खंड में संवर्धन ECFC के लिए वर्णित है.
  9. कोलेजन मैं लेपित 96 अच्छी तरह से प्लेटों को 50 μl कोलेजन चूहे की पूंछ प्रकार जोड़ने मैं (50 / μg मिलीलीटर) प्रति अच्छी तरह से तैयार है और रात भर के लिए थाली सेते हैं. का लीजिए TrypLE एक्सप्रेस का उपयोग करके EGFP + ECFCs और मध्यम ईजीएम-2 में उन्हें अंतिम ~ 10 6 कोशिकाओं मिलीग्राम / एकाग्रता के साथ resuspend.
  10. 20 कोशिकाओं / दूसरे के कम प्रवाह दर के साथ FACS सहूलियत (Becton डिक्सन) या अन्य तुलनीय सॉर्टर का प्रयोग एक ही EGFP + प्रति अच्छी तरह से ECFC 96 अच्छी तरह से थाली की तरह और ईजीएम-2 के साथ 200 μl प्रति अच्छी तरह से करने के लिए अंतिम मात्रा समायोजित. एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से केवल एक सेल प्राप्त Alternativ.इली, एकल कक्षों FSC और एसएससी और Sytox परमाणु डाई धुंधला कालोनियों सेल स्कोरिंग और मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के आधार पर हल किया जा सकता है.
  11. दो सप्ताह की अवधि में दो मीडिया (200 μl ईजीएम 2 का उपयोग कर multichannel pipetter के) बदलाव 5 दिन और 10 दिन पर प्रदर्शन के साथ थाली सेते हैं. संस्कृति के 14 दिन पर, 100 μl पीबीएस के साथ 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde की 100 μl के साथ कोशिकाओं को तय करने से पहले प्रत्येक अच्छी तरह से धो लो. ECFCs कि EGFP नहीं व्यक्त कर रहे हैं के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात निर्धारण सेते हैं paraformaldehyde के बाद Sytox अभिकर्मक, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट परमाणु डाई, जोड़ने.
  12. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग एक अच्छी तरह से जांच करने के लिए कि एक एकल कोशिका से 14 दिनों के लिए सभ्य विस्तार endothelial कोशिकाओं की संख्या quantitate. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, सकारात्मक रूप में 2 या अधिक endothelial कोशिकाओं के प्रसार के लिए () के साथ स्कोर कुओं और उन्हें आगे प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ दृश्य गिनती द्वारा कुल endothelial सेल गिनती के लिए जांच.
  13. टी प्रदर्शितवह डेटा कुओं प्राप्त endothelial सेल की संख्या के साथ: 2 से 50, 51-2000, और 2001 या अधिक, के रूप में माना जाता है: endothelial सेल समूहों, कम proliferative संभावित (LPP) ECFCs, और उच्च proliferative संभावित (HPP) क्रमशः ECFCs. ECFCs endothelial समूहों, LPPs, और HPPs को जन्म दे रही है जब 14 दिनों के लिए एक एकल कोशिका के स्तर पर संवर्धित प्रदर्शन द्वारा clonal proliferative क्षमता का पूरा पदानुक्रम 7.

सी. vivo में वाहिनियों के गठन परख में Vasculogenesis लिए ECFC क्षमता की जांच करने के लिए: vivo में ECFCs की कार्यात्मक विशेषता

  1. FBS (10: निम्न जेल सामग्री में से प्रत्येक के कुल (मिलीलीटर) मात्रा (कोष्ठक में अंतिम एकाग्रता के साथ) 1 मिलीलीटर जेल (जो बाद में 2 प्रत्यारोपण उत्पन्न bisected जाएगा) डाली की जरूरत की गणना के द्वारा cellularized जेल प्रत्यारोपण तैयार %), EBM-2 10:01 (1 मिलीग्राम के अंतिम मात्रा को समायोजित करने के लिए), सोडियम बाइकार्बोनेट (1.5 मिलीग्राम / एमएल), (7.4 पीएच समायोजित) NaOH, HEPES (25 मिमी), fibronecti(100 μg / एमएल) n कोलेजन और मैं (1.5 मिलीग्राम / एमएल).
  2. जेल सामग्री गणना के बाद, TrypLE एक्सप्रेस के साथ कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने है कि ECFC क्लोनिंग और विस्तार के लिए वर्णित किया गया था इसी तरह के तरीकों का उपयोग कर. एक एक hemacytometer और trypan नीले रंग का उपयोग कर अशेष भाजक के एक व्यवहार्य सेल गिनती प्राप्त करते हैं. एक 50 मिलीलीटर - शंक्वाकार ट्यूब और गोली 515 XG, कमरे के तापमान पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं में 2,4 मिलियन व्यवहार्य कोशिकाओं स्थानांतरण. इसके साथ ही, एक बर्फ ठंड 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब (एक ही आदेश के रूप में वे सूचीबद्ध हैं में) गणना HEPES के संस्करणों, सोडियम बिकारबोनिट, 10:01 EBM-2, FBS, fibronectin, और कोलेजन जोड़कर जेल मैट्रिक्स समाधान तैयार. मिश्रण अच्छी तरह से और 7.4 NaOH साथ पीएच जबकि बर्फ पर समाधान रखने समायोजित.
  3. Centrifugation के बाद कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 360 μl गर्म ईजीएम-2 में गोली फिर से निलंबित और यह करने के लिए पीएच जेल मैट्रिक्स समाधान की 840 μl समायोजित जोड़ने, जेल प्रत्यारोपण 1 मिलीग्राम की अंतिम मात्रा बनाने. जेल मैट्रिक्स समाधान में कोशिकाओं को धीरे धीरे मिश्रण जब तककोशिकाओं को अच्छी तरह से जेल समाधान में निलंबित कर रहे हैं.
  4. 12 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति थाली और 20-30 मिनट के लिए सेते हैं जब तक जेल polymerizes की अच्छी तरह से इस 1 मिलीलीटर cellularized है जेल निलंबन स्थानांतरण. धीरे 2 मिलीलीटर गर्म ईजीएम-2 के साथ जेल कवर और रात भर सेते हैं.
  5. तुरंत आरोपण से पहले, दो बराबर टुकड़ों में परितारिका कैंची का उपयोग रात में incubated जेल दोटूक करना और एक ही अच्छी तरह से ईजीएम - 2 मध्यम युक्त संस्कृति को जेल टुकड़े लौटने.
  6. शांत पशु isoflurane संज्ञाहरण administrating के द्वारा पशु शल्य चिकित्सा सुविधा का उपयोग करें (5-6 सप्ताह का इशारा / SCID चूहों). पेट के निचले हिस्से दाढ़ी और शराब पैड और betadine के या अन्य एंटीसेप्टिक के साथ अच्छी तरह से शल्य साइट को साफ. तो पर्दे के साथ IACUC और संस्थागत दिशा - निर्देशों के अनुसार क्षेत्र के अलग.
  7. बाँझ तेज परितारिका कैंची का उपयोग करने के लिए पेट के निचले वृत्त का चतुर्थ भाग में एक लगभग 5 मिमी चीरा बनाने के लिए, त्वचा और पेट की मांसपेशियों के बीच में चमड़े के नीचे का स्थान उजागर. पेट की मांसपेशियों से त्वचीय परत करने के लिए 15-20 मिमी चौड़ा ऊपरी पेट वृत्त का चतुर्थ भाग में बेहतर अग्रणी जेब बनाने के माध्यम से कुंद विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं. समान ही माउस पेट के दूसरे पक्ष में खुले जेब बनाने के लिए इसी तरह की प्रक्रिया दोहराएँ.
  8. पेट की जेब से एक और पक्ष में त्वचीय बस चीरा लांगुलिय परत उठाने से पेट की जेब से एक पक्ष में एक जेल का आधा टुकड़ा और जेल की एक और आधा टुकड़ा डालें.
  9. जैल की प्रविष्टि के बाद, 2-3 एक काटने सुई पर 5-0 polypropylene के सीवन का उपयोग कर टांके के साथ प्रत्येक चीरा बंद. उचित पिंजरे कार्ड लेबल और संस्थागत और प्रोटोकॉल आवश्यकताओं के प्रति के रूप में शल्य चिकित्सा के बाद निगरानी और analgesia प्रदर्शन और इन जैल में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के लिए 14 दिनों के डी Novo की vasculature को उत्पन्न करने के लिए अनुमति देते हैं.
  10. अंत में, जेल प्रत्यारोपण की कटाई आमतौर पर से माउस euthanizing के बाद 14 दिनों के आरोपण के बाद प्रदर्शन.
  11. शराब पैड के साथ पेट क्षेत्र और झाड़ूपेट मूल चीरा लाइन के लिए दुम का त्वचा में कटौती. ध्यान से, बाहर जेल के संभावित स्थान त्वचा लांगुलिय की एक प्रालंब excising द्वारा प्रत्यारोपण काटना. आबकारी प्रत्यारोपण जेल के आसपास circumferentially तो जस्ता लगानेवाला में जगह (बी.डी. बायोसाइंसेज, इष्टतम परिणामों के लिए निर्माता की सिफारिश का पालन) में कटौती और उन्हें कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए तय करने के लिए अनुमति देते हैं.
  12. आयल - एम्बेडेड जैल मानक Histochemical प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार है और तैयार करने के लिए गिलास स्लाइड पर 5 माइक्रोन वर्गों के hematoxylin और लाल भामसान रंग, विरोधी मानव CD31 या CD31 विरोधी माउस को जेल के भीतर vasculature कल्पना के साथ धुंधला प्रदर्शन. ECFCs humanized वाहिकाओं उत्पन्न करने के लिए डी Novo vasculogenesis से गुजरना cellularized में 14 4,8,11 दिनों के लिए जेल प्रत्यारोपण immunodeficient चूहों में डाला.

प्रतिनिधि डी. परिणाम

इस ECFC व्युत्पत्ति तकनीक का प्रयोग हम मनाया प्राथमिक कॉलोनी फार्म का विकास5 दिन (1 छवि) के रूप में जल्दी के रूप में व्यावहारिक. बाहर विकास ECFC कालोनियों ठेठ cobblestone उपस्थिति का प्रदर्शन किया और क्लोनिंग द्वारा कॉलोनी पिक के बाद लंबी अवधि के विस्तार पर 40 जनसंख्या दोहरीकरण को जन्म दिया है. विस्तारित कालोनियों endothelial प्रतिजनों व्यक्त की, लेकिन था व्यक्त छवि (2) नहीं hematopoietic प्रतिजनों. महत्वपूर्ण बात, वे एक एकल कोशिका स्तर छवि (3) में clonal proliferative क्षमता की एक पूरी पदानुक्रम का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, ECFCs में humanized रक्त वाहिकाओं है कि मेजबान लाल रक्त कोशिकाओं के साथ perfused जब immunodeficient चूहों 4, 6, 8, 11 (4 छवि) में प्रत्यारोपित कर रहे हैं का गठन किया था.

आकृति 1.
आकृति 1. सुसंस्कृत बहुराष्ट्रीय कंपनियों बहुराष्ट्रीय कंपनियों के रूप buffy कोट परत से गर्भनाल रक्त कोशिकाओं के घनत्व Ficoll Pague ढाल जुदाई के दौरान (ECFCs) कोशिकाओं के गठन mononuclear कोशिकाओं की हड्डी और endothelial कॉलोनी के रक्त परिणाम से अलगाव (एमएनसी). Buffy कोट परत के चूहे की पूंछ कोलेजन पर संस्कृति बहुराष्ट्रीय कंपनियों के लिए अलगाव मैं ECFC कॉलोनी की 5 से 14 दिनों में परिणाम में लेपित प्लेटें परिणाम. परिणाम ECFC कॉलोनी (तीर सिर से संकेत) cobblestone 7 आकारिकी प्रदर्शित.

चित्रा 2.
चित्रा 2. इन विट्रो में प्रतिनिधि endothelial और hematopoietic सेल सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति की प्ररूपी गर्भनाल रक्त प्राप्त ECFCs के मूल्यांकन Immunophenotyping से पता चला है कि ECFCs endothelial CD31 एंटीजन, CD34, CD144, CD146, फ्लाइट-1, FLK-1, फ्लाइट-4, और Nrp2 व्यक्त लेकिन hematopoietic CD45 एंटीजन, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 या AC133 7, 8 व्यक्त नहीं.

चित्रा 3.
चित्रा 3. किसी क्लोन से उत्पन्न होने वाला अथवा उससे बना हुआ और सीबी व्युत्पन्न ECFCs की proliferative संभावित इन विट्रो quantitation में प्रतिनिधि. (ए) गर्भनाल रक्त- व्युत्पन्न ECFCs 2-50 कोशिकाओं के समूहों से 2001> की कालोनियों को लेकर कालोनियों के एक पदानुक्रम के साथ proliferative संभावित प्रतिरूप प्रदर्शित करते हैं. (बी) कालोनियों (कालोनियों साथ, Sytox, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट परमाणु डाई करने के लिए बेहतर गुणवत्ता के चित्र ले दाग) के पदानुक्रम की micrographs के बाद प्राप्त गर्भनाल रक्त व्युत्पन्न ECFCs 14 दिनों के लिए एक एकल कोशिका के स्तर पर संवर्धित किया गया. स्केल बार 100μm 7, 8 का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 4.
चित्रा 4. गर्भनाल रक्त व्युत्पन्न ECFCs के vivo कार्यात्मक लक्षण वर्णन में प्रतिनिधि. ) एक रस्सी का धुंधला हो जाना और एच ई रक्त व्युत्पन्न cellularized जेल प्रत्यारोपण वाले ECFC मेजबान लाल रक्त कोशिकाओं से भरा आरोपण के 14 दिनों के बाद कोलेजन fibronectin जेल में गठन microvessel संकेत दिया. बी) विरोधी मानव CD31 धुंधला (भूरे रंग धुंधला हो जाना) और इन जहाजों के मानव मूल की पुष्टि करता है.

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Discussion

ख्यात endothelial पूर्वज कोशिकाओं के प्ररूपी और कार्यात्मक लक्षण वर्णन सदाशयी ECFCs कि clonally और फिर चढ़ाना serially संस्कृति में सक्षम हैं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है और टिकाऊ और कार्यात्मक vivo में प्रत्यारोपण रक्त वाहिकाओं को जन्म दे. मानव गर्भनाल रक्त ECFCs और उम्र बढ़ने या 10 रोग के साथ इन परिसंचारी कोशिकाओं गिरावट की एकाग्रता के साथ समृद्ध है. हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि ECFC संवहनी या संवहनी चोट, myocardial infarction, या 17-19 रेटिनोपैथी की स्थितियों में मरम्मत के उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं.

यहाँ, हम व्युत्पत्ति के लिए सरल और कुशल तरीके का वर्णन है, क्लोनिंग, विस्तार, और के रूप में मानव नाल की सीबी से ECFCs के vivo लक्षण वर्णन के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो. इन तरीकों के शोधकर्ताओं की पहचान करने के लिए और सीबी से सदाशयी निर्यात संवर्धन परिषदों जो clonal proliferative संभावित और अधिकारी को अलग

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

डा. Yoder EndGenitor टेक्नोलॉजीज इंक, सलाहकार और Rimedion टेक्नोलॉजीज इंक, बोर्ड के एक सदस्य के

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sodium Injection, USP APP Pharmaceuticals 504031
Ficoll-Pague Amersham 17-1440-03
Mixing cannula Maersk Medical 500.11.012
EGM-2 Lonza Inc. CC-3162
Defined FBS Hyclone SH30070.03
TrypLE express GIBCO, by Life Technologies 12605
Rat type I collagen BD Biosciences 354236
Matrigel BD Biosciences 356234
FcR Block Miltenyi Biotec 130-059-901
hCD31, FITC conjugated BD Biosciences 555445
hCD45, FITC conjugated BD Biosciences 555482
hCD14, FITC conjugated BD Biosciences 555397
hCD144, PE conjugated eBioscience 12-1449-80
hCD146, PE conjugated BD Biosciences 550315
hCD105, PE conjugated Invitrogen MHCD10504
Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated BD Biosciences 555748
Ms IgG1,k antibody, PE conjugated BD Biosciences 559320
Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated BD Biosciences 555573
Anti-human CD31 Dako clone JC70/A
Anti-mouse CD31 BD Biosciences 553370
0.22-μm vacuum filtration system EMD Millipore SCGPU05RE
Glacial acetic acid, 17.4N Fisher Scientific A38-500
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
IHC Zinc Fixative BD Biosciences 550523
Sytox green reagent Invitrogen S33025
Cloning cylinders, sterile Fisher Scientific 07-907-10

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान 62 अंक Endothelial कॉलोनी के गठन (ECFCs) कोशिकाओं endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) एक सेल कॉलोनी परख बनाने प्रसवोत्तर vasculogenesis के क्लोनिंग सेल संस्कृति,
Endothelial कॉलोनी सेल बनाने के प्ररूपी और कार्यात्मक विशेषता मानव नाल गर्भनाल रक्त से व्युत्पन्न
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Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (62), e3872, doi:10.3791/3872 (2012).

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