Summary

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Published: April 13, 2012
doi:

Summary

בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) מסתובבים לתאי אנדותל עם פוטנציאל חזק שגשוג משובט המוצגים מהותי<em> In vivo</emכלי> יצירת היכולת. אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים תוצאה אנדותל הנגזרות CB חשוב לזהות ולבודד<em> בתום לב</em> ECFCs עבור יישומים קליניים פוטנציאל בתיקון רקמות שניזוקו.

Abstract

צפיות ארוכת שנים של יצירת כלי דם חדשים באמצעות אנגיוגנזה, vasculogenesis, ו arteriogenesis נבדקו לאחרונה 1. הנוכחות של מחזורי ובתאים אנדותל (EPCs) זוהו לראשונה על ידי אסהאךה ואח' בדם למבוגרים היקפי האדם. בשנת 1997 2 להביא עירוי של השערות ואסטרטגיות חדשות התחדשות תיקון כלי הדם. EPCs הם מרכיבים נדירים אבל נורמלי של מחזורי הדם בבית לאתרים של היווצרות כלי דם או שיפוץ כלי הדם, ולאפשר גם vasculogenesis אנגיוגנזה לאחר הלידה, או arteriogenesis בעיקר באמצעות גירוי paracrine החומה כלי הקיים נובע תאים 3. סמן לא ספציפי לזהות EPC זוהה, וכיום המדינה השדה הוא להבין כי סוגי תאים רבים, כולל גזע hematopoietic proangiogenic ו ובתאים, מחזורי תאים angiogenic, Tie2 + ומונוציטים, cel אבי מיאלואידיתls, מקרופאגים הקשורים הגידול, מקרופאגים משופעלים מסוג M2 להשתתף מגרה את תהליך angiogenic במגוון רחב של מערכות מודל פרה בעלי חיים והן בבני אדם במדינות רבות המחלה 4, 5. בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) הם תאים נדירים במחזור אנדותל קיימא המאופיינים פוטנציאל חזק שגשוג משובט, המושבה משני שלישוני היכולת להרכיב על replating, ואת היכולת ליצור כלי מהותי ב vivo גבי השתלת לעכברים immunodeficient 6-8. בעוד ECFCs היו מבודדים בהצלחה מדם היקפי של נושאים בוגרים בריאים, חבל הטבור דם (CB) של תינוקות בריאים, והקיר כלי של מספר רב של כלי עורקי וורידי אדם 6-9, CB הוא בעל התדירות הגבוהה ביותר של ECFCs 7 כי התצוגה את הפוטנציאל הכי חזקים שגשוג משובט וצורה כלי דם עמיד תפקודית 8 vivo, 10-13. בעוד גזירתECFC מדם היקפי מבוגר הוצגה 14, 15, כאן נתאר את מתודולוגיות הגזירה, שיבוט ההרחבה, במבחנה, כמו גם אפיון vivo של ECFCs מן הטבור CB האדם.

Protocol

ריאגנטים פתרונות EMG-2 Media (Lonza, חתול. מספר cc-3162 המכיל EBM-2 בינוני הבסיסי ו-EGM 2 ערכת תוספי SingleQuot, & גורמי גדילה) EBM-2 (Lonza, חתול. מספר cc-3156) השלים עם ערכת תוספי כל SingleQuot שימוש גורמי גדילה (Lonza, חתול. מספר cc-417…

Discussion

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של המשוערים ובתאים אנדותל חשוב לזהות את ECFCs חרוצים וישרי דרך המסוגלים clonally ו סדרתי מחדש ציפוי בתרבות להצמיח עמיד ופונקציונלי כלי דם להשתלה in vivo. דם אדם חבל הטבור הוא מועשר ECFCs וריכוז אלה ירידות במחזור תאים עם הזדקנות או מחלה 10.</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ד"ר Yoder הוא יועץ טכנולוגיות EndGenitor, Inc וחבר מועצת המנהלים של Rimedion Technologies, Inc

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Heparin Sodium Injection, USP APP Pharmaceuticals 504031
Ficoll-Pague Amersham Biosciences 17-1440-03
Mixing cannula Maersk Medical 500.11.012
EGM-2 Lonza CC-3162
Defined FBS Hyclone SH30070.03
TrypLE express Gibco 12605
Rat type I collagen BD Biosciences 354236
Matrigel BD Biosciences 356234
FcR Block Miltenyi Biotech 130-059-901
hCD31, FITC conjugated BD Pharmingen 555445
hCD45, FITC conjugated BD Pharmingen 555482
hCD14, FITC conjugated BD Pharmingen 555397
hCD144, PE conjugated eBioscience 12-1449-80
hCD146, PE conjugated BD Pharmingen 550315
hCD105, PE conjugated Invitrogen MHCD10504
Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated BD Pharmingen 555748
Ms IgG1,k antibody, PE conjugated BD Pharmingen 559320
Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated BD Pharmingen 555573
Anti-human CD31 Dako clone JC70/A
Anti-mouse CD31 BD Pharmingen 553370
0.22-μm vacuum filtration system Millipore SCGPU05RE
Glacial acetic acid, 17.4N Fisher A38-500
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
IHC Zinc Fixative BD Biosciences 550523
Sytox green reagent Invitrogen S33025
Cloning cylinders, sterile Fisher Scientific 07-907-10

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  2. Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  3. Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
  4. Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
  5. Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
  6. Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
  7. Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
  10. Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
  11. Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
  12. Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
  13. Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
  14. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
  15. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
  16. Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
  17. Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
  18. Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
  19. Medina, R. J., O’Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).

Play Video

Cite This Article
Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (62), e3872, doi:10.3791/3872 (2012).

View Video