Summary
Endotele kolonidannende celler (ECFCs) er cirkulerende endotelceller med robust klonale proliferativt potentiale, som skal vises iboende
Abstract
Mangeårige visninger af nye blodkar dannes via angiogenese, vaskulogenese, og arteriogenesis er for nylig blevet revideret 1. Tilstedeværelsen af cirkulerende endotelceller progenitorceller (EPC'erne) blev først identificeret i voksent humant perifert blod ved Asahara et al. 1997 to bringe en infusion af nye hypoteser og strategier for vaskulær regenerering og reparation. EPC'er er sjældne, men normale komponenter i cirkulerende blod, hjem til steder med blodkar dannes eller vaskulær remodellering, og lette enten postnatal vaskulogenese, angiogenese, eller arteriogenesis hovedsageligt via paracrin stimulering af eksisterende karvæggen stammer celler 3. Ingen specifik markør for at identificere en EPC er blevet identificeret, og i øjeblikket status af feltet er at forstå, at mange celletyper, herunder proangiogene hæmatopoietiske stamceller og stamceller, cirkulerende angiogene celler, Tie2 + monocytter, myeloid stamfader cells, tumorassocierede makrofager, og M2 aktiverede makrofager deltage i stimulering af angiogene proces i en række af prækliniske dyremodelsystemer og i humane patienter i talrige sygdomstilstande 4, 5. Endotele kolonidannende celler (ECFCs) er sjældne cirkulerende levedygtige endotelceller karakteriseret ved en robust klonal proliferativt potentiale, sekundære og tertiære kolonidannende evne ved genudpladning, og evne til at danne indre in vivo fartøjer ved transplantation i immundefekte mus 6-8. Mens ECFCs er blevet isoleret fra det perifere blod af sunde voksne personer, navlestrengsblod (CB) af sunde nyfødte og karvæggen for talrige humane arterielle og venøse kar 6-9, CB har den højeste frekvens af ECFCs 7, der vises den mest robuste klonale proliferativt potentiale og form holdbare og funktionelle blodkar in vivo 8, 10-13. Mens udledning afECFC fra voksne perifert blod er blevet præsenteret 14, 15, Her beskrives metoder til afledning, kloning, ekspansion og in vitro såvel som in vivo karakterisering af ECFCs fra human umbilical CB.
Protocol
Reagenser og løsninger
EMG-2-medier (Lonza, kat. Nr. cc-3162 indeholder EBM-2 basalmediet og EGM-2 SingleQuot kit Kosttilskud, og vækstfaktorer)
EBM-2 (Lonza, kat. Nr. cc-3156) suppleret med hele SingleQuot kit kosttilskud og vækstfaktorer (Lonza, kat. Nr. cc-4176), 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin (10.000 U / ml) / streptomycin (10.000 ug / ml) / amphotericin (25 ug / ml). Gem op til 1 måned ved 4 ° C. Anbefalede EGM-2 volumener til brug for ECFC kultur 500 gl / brønd i 24-brøndsplader, 2 ml / brønd i 6-brøndsplader, 5ml/25-cm 2 kolber og 10 ml/75-cm 2 kolber, medmindre andet er angivet i protokollen.
Kollagen I opløsning
Fortyndes 0,575 ml iseddikesyre (17.4N) i 495 ml sterilt destilleret vand (0,02 N slutkoncentration). Sterilfilter fortyndet eddikesyre med en 0,22 um vacuum filtreringssystem. Tilsættes 25 mg rotte hale kollagen I til fortyndet eddikesyre til en endelig koncentration på 50 ug / ml. Mængden af kollagen tilsættes, vil variere afhængigt af collagen stamkoncentration. Gem op til en måned ved 4 ° C.
Fremstillinq af collagen I-coatede vævskulturskåle overflader
Sted 1 ml collagen I-opløsning i hver brønd af en 6-brønds vævskulturplade (anvende 300 gl / brønd i 24-brøndsplader, 3ml/25-cm 2 kolber, og 8 ml/75-cm 2 kolber). Inkuber 1 time til natten over ved 37 ° C. Fjerne collagen I-opløsningen og vaskes overfladen to gange, hver gang med PBS (anvende 500 gl / brønd i 24-brøndsplader, 2 ml / brønd i 6-brøndsplader, 5ml/25-cm 2 kolber og 10 ml/75 -cm2 kolber). Brug plader umiddelbart til cellekulturer.
FACS-farvning puffer
Phosphatpufret saltvand (PBS) suppleret med 2% (v / v) føtalt bovint serum (FBS). Store up til 2 uger ved 4 ° C.
A. ECFC udvækst Kloning og ekspansion
- Indsamler CB med heparin (10 U heparin / ml blod) eller EDTA som antikoagulerende middel og transport til laboratoriet ved stuetemperatur og øjeblikkeligt (inden for 2 timer efter barnets levering) fremgangsmåde prøven til mononukleære celler (MNC) isolation.
- Portion 15 ml CB i hver 50 ml konisk centrifugeglas og der tilsættes 20 ml PBS til hvert rør for CB og pipetten adskillige gange for at blande. Udarbejd 15 ml Ficoll-Paque til en 20-ml sprøjte og vedlægge en 20G nål eller blanding kanyle. Placere spidsen af blandingen kanyle i bunden af røret af fortyndet blod og omhyggeligt Folien 15 ml Ficoll-Pague. Centrifuger rørene 30 minutter ved 740 x g ved stuetemperatur, uden deceleration bremse indstilling.
- Ved hjælp af overførsel pipette til at fjerne den uklare lag med lav densitet MNC'er placeret ved grænsefladen mellem Ficoll-Paque og fortyndet plasma. Dispenseres MNC'er i en 50 ml konisk rør containing 10 ml EGM-2 medium. Centrifugeres MNC'er 10 minutter ved 515 x g ved stuetemperatur, med en høj deceleration bremse indstilling.
- Omhyggeligt Aspirér og kassér supernatanten. Vask de pelleterede celler med EGM-2 gange (10 minutter ved 515 x g) og genopslæmmes i MNC'er i EGM-2 ved 1,25 x 10 7 celler / ml. Fremstille collagen I overtrukne 6-brønds vævskulturplader ved tilsætning af 1 ml rotte-hale collagen type I (50 ug / ml) per brønd og inkubere pladen natten over. Pipette 4 ml af denne MNC suspension til hver brønd og placere celler i 37 ° C, 5% CO2 befugtet inkubator. A.1.5) Efter 24 timer (dag 1), langsomt fjernes det brugte medium (ikke forstyrrer de løst adhærerende celler) fra brønden med en pipette, tilsættes langsomt 4 ml EGM-2 til brønden, og returnere pladen til inkubatoren . På dag 2. Opdatere mediet ved langsomt at fjerne mediet (ikke forstyrrer de løst adhærerende celler) fra brønden med en pipette og tilsætning af 4 ml EGM-2 til hver brønd Gentag mediet ændringen daglige unthe dag 7 og hver anden dag derefter indtil ECFC kolonier synes til kloning. Typisk kolonier forekommer mellem dag 5 og dag 14 dage 7 (fig. 1).
- Visualiser typiske ECFC kolonier med brosten morfologi ved hjælp af omvendt mikroskop (forstørrelse 10x) og markere de koloni grænser med en markør på undersiden af brønden for at angive positionen af hver koloni.
- På dag 14, vaske disse primære kolonier 2 gange med PBS og høst individuelle kolonier ved anvendelse af kloningscylindre og lige nok TrypLE udtrykkeligt at dække cellerne inde i cylindrene. Efter aspirering den sidste vask af PBS, anbringes en steril gel overtrukket kloning cylinder omkring hver koloni og tryk fast mod pladen med sterile pincetter. Tilsæt 2-3 dråber varmt TrypLE udtrykker i hver kloning cylinder og inkuberes i 3-5 min, indtil cellerne i cylinderen begynder at løsne sig. Tilsæt ca 250 pi EGM-2 medium ind i midten af cylinderen og pipetteres op og ned generate enkelt cellesuspension. Overføre enkelt cellesuspension fra hver kloning cylinder separat i et individ mikro-centrifugerør.
- Vask området inden i cylinderen 2-3 gange med cirka 250 ul EGM-2 medium at samle alle de tilbageværende celler og overfør vask af hver cylinder til den respektive mikro-centrifugerør. Centrifugeres cellerne ved høj hastighed (≤ 300 xg) i bordcentrifuge i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1,5 ml frisk EGM-2 medium. Overfør cellesuspensionen (indeholdende alle celler fra individuelle kolonier) fra hvert rør i en brønd af en 24-brønds vævskulturplade præ-overtrukket med 500 ul rotte-hale collagen I (50 ug / ml).
- Placer inde i inkubator for udbygning med medierne ændre udføres hver anden dag.
- Når celler nærmer 80-90% konfluens, fjernes det brugte medium og derefter vaskes cellerne 2 gange med PBS, og der tilsættes 500 pi TrypLE udtrykkeligt medium til hver brønd24-brønds vævskulturplade. Pladen anbringes i inkubatoren i 3-5 minutter, indtil cellerne begynder at runde op og tag. Tilsæt 1 ml EGM-2 (med 10% defineret FBS) til hver brønd for at indsamle cellerne ved vask og overføre dem til et 15 ml rør. Vaskes godt med 1 ml EGM-2 medium at samle alle de tilbageværende celler og overfør vask af hver brønd i henholdsvis 15 ml rør. Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 min.
- Fjernelse af mediet og resuspender cellepelleten i 1 ml frisk EGM-2-medium (med 10% defineret FBS). Opnåelse af levedygtige celletal i en portion under anvendelse af et hæmacytometer og trypanblåt-udelukkelse.
- Ekspandere cellerne ved podning omkring 5000 celler/cm2 på et collagen I præ-coatede vævskulturskåle overflader i EGM-2-medier med mediet ændres hver anden dag indtil cellerne nærmer 80-90% konfluens før sub-dyrkning igen.
B. In vitro fænotypisk karakterisering af ECFCs: endotelcelleoverfladen antigenekspression end enkelt celleanalyse for klonale proliferative potentiale
- For endotelcelleoverfladen antigenekspression, løsnes cellerne med TrypLE udtrykker til at indsamle celler ved anvendelse af fremgangsmåder beskrevet for ECFC kloning og ekspansion.
- Resuspendere cellerne i FACS-farvning buffer (10 x 10 6 celler / 1 ml FACS farvningsbuffer) tilsæt derefter FcR blokerende reagens (20 ul / 10 x 10 6 celler), blandes forsigtigt og anbring på is i 10 min.
- Aliquot 100 ul af denne cellesuspension i mikro-centrifugerør for hver endotel-overfladeantigen og isotype kontrol. Tilsættes passende mængde af fluorokrom-mærkede humane monoklonale antistoffer, som genkender endothelceller antigener (CD31, CD144, CD146 og CD105) eller hæmatopoietiske antigener (CD45, og CD14) og efterlade på is i 30 minutter beskyttet mod lys. Advarsel: 1 x 10 6 celler Der kræves ikke for hver test. Forfatterne typisk fremstilling 0,5 til 1 x 10 5 celler / rør til opnåelse af 2 x 10 4 analysered begivenheder. Også følge producentens anbefaling for mængden af antistof, der skal anvendes til hver test. Nogle antistoffer kan kræve titrering til bestemmelse af den optimale antistofkoncentration. Alle farvning, at forfatterne har udført er enkelt farve farvning.
- Efter 30 minutters inkubation på is hvert rør centrifugeres ved høj hastighed på en bordcentrifuge i 5 minutter og fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i FACS buffer.
- Analysere prøverne på et flowcytometer at bestemme procentdelen af celler, der farves positivt eller negativt for hvert antigen. ECFCs farvning ensartet positive for CD31, CD144 og CD146, men negative for CD45 og CD14 sammenlignet med de tilsvarende isotype kontrol.
- Til enkelt-celle-assay for at undersøge den klonale proliferative potentiale, løsnes tidlig passage (2-3) celler med TrypLE udtrykker til at indsamle cellerne under anvendelse af fremgangsmåder svarende til den, der blev beskrevet ECFC kloning og ekspansion.
- Inficere disse cellermed forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), der udtrykker lentivirus 16 og opsamle celler, der udtrykker EGFP ved fluorescens cytometri Forsigtig:. Arbejde med lentivirus betragtes som en biologisk fare, og alle bio-sikkerhedsforanstaltninger skal overholdes.
- Kultur dem som beskrevet for dyrkning ECFC i afsnittet for ECFC ekspansion.
- Fremstille collagen I overtrukne 96-brønds plader ved tilsætning af 50 ul rotte-hale collagen type I (50 ug / ml) pr brønd og inkuber pladen natten over. Indsamle eGFP + ECFCs ved hjælp TrypLE udtrykkelig og resuspenderes dem i EGM-2-medium med slutkoncentration ~ 10 6 celler / ml.
- Anvender FACS Vantage (Becton Dickson) eller tilsvarende sorteringsenhed med lav strømningshastighed på 20 celler / sekund til at sortere en enkelt EGFP + ECFC per brønd af en 96-brønds plade og indstille slutvolumenet til 200 pi per brønd med EGM-2. Brug en omvendt fluorescens mikroskop for at sikre, at hver brønd modtog kun en celle. AlternativEly, kan enkelte celler sorteres baseret på FSC og SSC og Sytox nukleare farvestofpletning kolonier kan anvendes til celle scoring og kvantificering.
- Inkubér pladen over en periode på to uger med to medieændringer (200 ul EGM-2 under anvendelse af multikanal-pipette) udført på dag 5 og dag 10. På dag 14 af kulturen vaskes hver brønd med 100 ul PBS før fastsættelse af cellerne med 100 gl af 4% paraformaldehyd i 30 min. For ECFCs, der ikke udtrykker EGFP tilsættes Sytox reagens, et grønt fluorescerende nuklear farvestof efter paraformaldehydfiksering og inkuber ved 4 ° C natten over.
- Anvende et fluorescensmikroskop for at undersøge hver brønd for at kvantificere antallet af endotelceller, som udvides fra en enkelt celle dyrket i 14 dage. Til kvantitativ analyse. Score brønde med 2 eller flere endotelceller som positiv (for proliferation) og undersøge dem yderligere til i alt endotelcelletal ved visuel tælling med fluorescensmikroskop
- For at vise tHan opnåede data, brønde med en endotelcelle antal: 2 til 50, 51 til 2000 og 2001 eller mere, betragtes som: endotelceller celleklynger, lav proliferativt potentiale (LPP)-ECFCs og højt proliferativt potentiale (HPP) - ECFCs hhv. ECFCs udstille komplet hierarki af klonal proliferativt potentiale ved at give anledning til endotel klynger, LPPS og HPPs, når de dyrkes på en enkelt celle niveau for 14 dage. 7
C. In vivo funktionelle karakterisering af ECFCs: In vivo Fartøj Dannelse Assay at undersøge ECFC potentiale for vasculogenese
- Forberede cellularized gel implantater ved at beregne det totale volumen (ml) af hver af de følgende gelmaterialer (med den endelige koncentration i parentes) for at afgive en-ml gel (som senere vil blive gennemskåret for at generere 2 implantater): FBS (10 %), EBM-2 10:01 (indstille slutvolumenet til 1 ml), natriumbicarbonat (1,5 mg / ml), NaOH (justere pH til 7,4), HEPES (25 mM), fibronectin (100 ug / ml), og collagen I (1,5 mg / ml).
- Efter gelmateriale beregning, løsnes cellerne med TrypLE udtrykker til at indsamle cellerne under anvendelse af fremgangsmåder svarende til den, der blev beskrevet ECFC kloning og ekspansion. Opnåelse af en tælling af levedygtige celler af en aliquot under anvendelse af et hæmacytometer og trypanblåt. Overføre 2,4 millioner levedygtige celler i en 50 ml konisk rør og pelletere cellerne ved centrifugering ved 515 x g, stuetemperatur. Samtidig fremstilling gelmatrix opløsning ved tilsætning af beregnede rumfang HEPES, natriumbicarbonat, EBM-2 10:1 FBS, fibronectin og collagen til en iskold 50 ml konisk rør (i den samme rækkefølge som de er vist). Blandes grundigt og pH indstilles til 7,4 med NaOH og samtidig holde opløsningen på is.
- Bortkast supernatanten fra cellerne efter centrifugering og genopslæmmes pelleten i 360 pi varm EGM-2 og det tilføje pH justeret 840 pi gelmatrix opløsning, hvilket gør det endelige volumen af gel implantatet 1 ml. Blandes cellerne i gelmatrixen opløsningen langsomt, indtilCellerne grundigt suspenderes i gelen opløsningen.
- Overføre 1 ml cellularized gelsuspension til en brønd af en 12-brønds vævskulturplade og inkuberes i 20-30 minutter, indtil gelen polymeriserer. Forsigtigt omfatter gelen med 2 ml varmt EGM-2 og inkuber natten over.
- Umiddelbart før implantation, gennemskærer natten over inkuberede gelen i to lige store stykker med iris saks og returnere gelstykker i den samme kultur brønd indeholdende EGM-2 medium.
- Anvende dyret kirurgiske facilitet til bedøve dyret (5-6 uger gamle NOD / SCID-mus) efter administration af isofluran-anæstesi. Barbering den nedre del af abdomen og grundigt rense det kirurgiske sted med alkoholservietter og Betadine eller antiseptisk. Derefter isolere området med gardiner pr IACUC og institutionelle retningslinjer.
- Med sterile skarpe iris saks til at foretage en tilnærmelsesvis 5 mm snit i den nedre kvadrant af maven, og udsætter det subkutane rum mellem huden og abdominale muskler. Udføre stump-dissektion gennem det dermale lag fra den abdominale muskler til at skabe en 15-20 mm bred lomme fører overlegen i den øvre abdomen kvadrant. Gentage lignende fremgangsmåde til at oprette lignende åben lomme i en anden side af samme mus maven.
- Indsætte en halv stykke gel i den ene side af abdominal lommen og en anden halv stykke gel til en anden side af den abdominale lommen ved at løfte det dermale lag blot caudalt til incisionen.
- Efter indsættelse af geler, lukkes hvert indsnit med 2-3 sting med 5-0 polypropylen suturen på en skærende nål. Passende mærke de bur kortene og udføre postoperativ overvågning og analgesi som pr institutionelle og protokol krav og give 14 dage for celler i disse implanteret geler til at generere de novo kar.
- Endelig høst af implantater typisk udført 14 dage efter implantation efter euthanizing musen.
- Aftør abdominale område med alkoholservietter ogskæres den abdominale hud caudalt til den oprindelige snitlinien. Forsigtigt dissekere ud implantatet ved udskæring en hudlap caudalt til det sandsynlige sted for gelen. Excise implantatet ved at skære omkredsen omkring gelen derefter sted i zink fiksativ (BD Biosciences, følg producentens anbefaling for optimale resultater) og give dem mulighed for at fastsætte i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Fremstille paraffin-indlejrede geler under anvendelse af standard histokemiske protokoller og forberede 5 um snit på objektglas til at udføre farvning med hæmatoxylin og eosin, anti-human CD31 eller anti-muse CD31 at visualisere vaskulaturen i gelen. ECFCs undergår de novo vaskulogenese at generere humaniserede fartøjer i cellularized gel implantater indsat i immundefekte mus i 14 dage ,4,8,11.
D. Repræsentative resultater
Brug af denne ECFC udledning teknik, som vi har observeret ud-vækst af primær koloni formulartion så tidligt som dag 5 (Fig. 1). De ud-vækst ECFC kolonier udstillet typisk brosten udseende og gav anledning til> 40 populationsfordoblinger upon langsigtet udvidelse efter koloni afhentning ved kloning. Udvidede kolonier udtrykt endoteliale antigener, men gav ikke udtryk bloddannende antigener (fig. 2). Vigtigt, at de viste en fuldstændig hierarki af klonal proliferativt potentiale ved en enkelt celle niveau (fig. 3). Desuden ECFCs dannet humaniserede blodkar, der er perfunderet med værts RBC'er når de implanteres i immundefekte mus 4, 6, 8, 11 (fig. 4).
Figur 1. Isolering af mononukleære celler (MNC'er) fra navlestrengsblod og udvækst af endothelial kolonidannende celler (ECFCs) fra dyrkede MNC'er. MNC'er form, buffy coat-laget i Ficoll-Pague densitetsgradient separation af navlestrengsblodceller. Isolering af buffy coat-laget til kulturen MNC'er på rotte-hale kollagen I overtrukne plader resulterer i udvækst af ECFC koloni i 5 til 14 dage. Udvæksten ECFC koloni (angivet med pilespidser), der vises brosten morfologi 7.
Figur 2. Repræsentative in vitro fænotypisk vurdering af endotel-og hæmatopoietisk celle-overfladeantigen-ekspression. Immunofænotypebestemmelse af navlestrengsblod-afledte ECFCs afslørede, at ECFCs udtrykt endotelceller antigener CD31, CD34, CD144 og CD146 og Flt-1, Flk-1, Flt-4, og Nrp2 men ikke udtrykke bloddannende antigener CD45, CD14, CD11b, ckit, CXCR4 eller AC133 7, 8.
Figur 3. Repræsentative in vitro kvantificering af klonogene og proliferative potentiale af CB afledt ECFCs. (A) navlestrengsblod-Afledte ECFCs vise klonale proliferativt potentiale med et hierarki af kolonier spænder fra klynger af 2-50 celler op til kolonier af> 2001. (B) Mikrografer hierarki af kolonier (kolonier farves med, Sytox, et grønt fluorescerende nukleare farvestof til at tage bedre billeder) opnået efter navlestrengsblod-afledt ECFCs blev dyrket på et enkelt celle niveau for 14 dage. Skala søjle repræsenterer 100 um 7, 8.
Figur 4. Repræsentant in vivo funktionelle karakterisering af navlestrengsblod-afledte ECFCs. A) H & E-farvning af navlestrengsblod-afledt ECFC indeholdende cellularized gel implantater angivet mikrokar (fyldt med værts RBC'er) dannelse i collagen-fibronectin gel efter 14 dages implantation. B) Anti-humane CD31-farvning (brun farvning) yderligere bekræfter den menneskelige oprindelse af disse fartøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fænotypisk og funktionel karakterisering af formodede endoteliale stamceller er vigtigt at identificere de bona fide ECFCs der er i stand til kloner og serielt re-plating i kultur og give anledning til holdbare og funktionelle implantable blodkar in vivo. Humant navlestrengsblod er beriget med ECFCs og koncentrationen af disse cirkulerende celler aftager med ældning eller sygdom 10. Nylige undersøgelser tyder på, at ECFC kan spille vigtige roller i vaskulær reparation eller regeneration i situationer med vaskulær beskadigelse, myocardial infarkt eller retinopati 17-19.
Her har vi beskrevet enkle og effektive metoder til afledning, kloning, ekspansion, og in vitro såvel som in vivo karakterisering af ECFCs fra human navlestreng CB. Disse metoder gøre det muligt for forskerne at identificere og isolere bona fide EPC'er fra CB som besidder klonede proliferativ potentiale og
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dr. Yoder er konsulent for EndGenitor Technologies, Inc. og medlem af bestyrelsen for Rimedion Technologies, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
