Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed
Summary
Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te geven<em> In vivo</em> Vat het vormen van vermogen. Fenotypische en functionele karakterisering van uitgroei endotheliale cellen afkomstig van CB zijn belangrijk om te identificeren en te isoleren<em> Bona fide</em> ECFCs voor potentiële klinische toepassing bij het herstel van beschadigde weefsels.
Abstract
Sinds zeer lange tijd uitzicht op de vorming van nieuwe bloedvaten via angiogenese, vasculogenese en arteriogenese zijn onlangs beoordeeld 1. De aanwezigheid van circulerende endotheliale voorlopercellen (EPC's) werden voor het eerst geïdentificeerd in volwassen menselijke perifeer bloed door Asahara et al.. In 1997 2 het instellen van een infusie van nieuwe hypothesen en strategieën voor vasculaire regeneratie en reparatie. EPC's zijn zeldzaam, maar de normale componenten van het circulerende bloedvolume dat huis naar sites van bloedvatvorming of vasculaire remodellering, en grotendeels te vergemakkelijken of postnatale vasculogenese, angiogenese, of arteriogenese via paracriene stimulatie van de bestaande vaatwand afgeleide cellen 3. Er is geen specifieke marker om een EPC te identificeren is geïdentificeerd, en op dit moment de staat van het veld is om te begrijpen dat een groot aantal soorten cellen, waaronder proangiogenic hematopoietische stamcellen en progenitorcellen, circulerende angiogene cellen, Tie2 + monocyten, myeloïde progenitor cells, tumor geassocieerde macrofagen en M2 geactiveerde macrofagen deel stimuleren angiogene proces verscheidene preklinische diermodelsystemen en bij mensen in talrijke ziektetoestanden 4, 5. Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) zijn zeldzaam circulerende levensvatbare endotheliale cellen kenmerkt zich door robuuste klonale proliferatie potentieel, secundaire en tertiaire kolonievormende mogelijkheid op opnieuw platen, en het vermogen om intrinsieke vormen in vivo schepen bij de transplantatie in immunodeficiënte muizen 6-8. Terwijl ECFCs zijn met succes geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde volwassen personen, navelstrengbloed (CB) van gezonde pasgeboren baby's, en de vaatwand van een groot aantal menselijke arteriële en veneuze vaten 6-9, CB bezit de hoogste frequentie van ECFCs 7 dat scherm de meest robuuste klonale proliferatieve potentieel en de vorm duurzaam en functioneel bloedvaten in vivo 8, 10-13. Hoewel de afleiding vanECFC volwassen perifeer bloed is ingediend 14, 15, hier de methoden voor het afleiden beschrijven klonen expansie en in vitro als in vivo karakterisering van ECFCs van het menselijk umbilical CB.
Protocol
Discussion
Fenotypische en functionele karakterisering van vermeende endotheliale voorlopercellen is belangrijk om de bonafide ECFCs die in staat zijn klonaal en serieel re-plating in cultuur te identificeren en aanleiding geven tot duurzaam en functioneel implanteerbare bloedvaten in vivo. Human navelstrengbloed is verrijkt met ECFCs en de concentratie van deze circulerende cellen neemt af met het ouder worden of ziekte 10. Recente studies suggereren dat ECFC kan een belangrijke rol in vasculaire repa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Yoder is consultant voor EndGenitor Technologies, Inc en lid van de raad van Rimedion Technologies, Inc
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 |
| Ficoll-Pague | Amersham Biosciences | 17-1440-03 |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 |
| TrypLE express | Gibco | 12605 |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 |
| FcR Block | Miltenyi Biotech | 130-059-901 |
| hCD31, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555445 |
| hCD45, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555482 |
| hCD14, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555397 |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 |
| hCD146, PE conjugated | BD Pharmingen | 550315 |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555748 |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Pharmingen | 559320 |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555573 |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A |
| Anti-mouse CD31 | BD Pharmingen | 553370 |
| 0.22-μm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU05RE |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher | A38-500 |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O’Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
