Summary
Endotelceller kolonibildande celler (ECFCs) cirkulerar endotelceller med robust klonal proliferativ potential som visar inneboende
Abstract
Långvariga utsikt över New blodkärl via angiogenes, vaskulogenes och arteriogenes har nyligen omdömet 1. Förekomsten av cirkulerande endotelceller stamceller (EPC) först identifierades i vuxen människa perifert blod genom Asahara et al. 1997 2 väcka infusion av nya hypoteser och strategier för vaskulär regeneration och reparation. EPCs är sällsynta, men normala komponenter i cirkulerande blod som hem till platser för blodkärlsbildning eller vaskulär remodellering, och underlätta antingen postnatal vaskulogenes, angiogenes, eller arteriogenes till stor del via olika typer av stimulering av befintlig kärlväggen härrör celler 3. Ingen specifik markör för att identifiera en EPC har identifierats, och för närvarande tillstånd av fältet är att förstå att många celltyper inklusive proangiogen hematopoetiska stam-och progenitorceller, cirkulerande angiogena celler, Tie2 + monocyter, myeloid progenitor cells, tumörassocierade makrofager, och M2 aktiverade makrofager delta i att stimulera den angiogena processen i en mängd av prekliniska djurmodellsystem och humanpatienter i ett flertal sjukdomstillstånd 4, 5. Endotelceller kolonibildande celler (ECFCs) är sällsynta cirkulerande livskraftiga endotelceller kännetecknas av en stark klonal proliferativ potential, sekundär och tertiär kolonibildande förmågan vid återutstrykning och förmåga att bilda inneboende in vivo kärl vid transplantation till immundefekta möss 6-8. Även ECFCs har framgångsrikt isolerats från perifert blod hos friska vuxna individer, navelsträngsblod (CB) av friska nyfödda barn, och kärlväggen av många mänskliga arteriella och venösa kärl 6-9, har CB den högsta frekvensen av ECFCs 7 som visas den mest robusta klonal proliferativ potential och form hållbara och funktionella blodkärl in vivo 8, 10-13. Medan härledning avECFC från perifert blod från vuxna har presenterats 14, 15, här beskriver metoder för härledning, kloning, expansion, och in vitro såväl som in vivo karakterisering av ECFCs från humana umbilikala CB.
Protocol
Reagens och lösningar
EMG-2 media (Lonza, Cat. Nr cc-3162 innehåller EBM-2 basalmedium och EGM-2 SingleQuot Kosttillskott kit, & tillväxtfaktorer)
EBM-2 (Lonza, kat nr. Cc-3156) kompletterat med hela tillskott SingleQuot kit och tillväxtfaktorer (Lonza, Kat nr. Cc-4176), 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) penicillin (10.000 U / ml) / streptomycin (10.000 xg / ml) / amfotericin (25 pg / ml). Lagra upp till 1 månad vid 4 ° C. Rekommenderade EGM-2 volymer för att använda för ECFC kultur är 500 | il / brunn för 24-brunnsplattor, 2 ml / brunn i 6-brunnars plattor, 5ml/25-cm 2 kolvar, och 10 ml/75-cm 2 kolvar, såvida annat anges i protokollet.
Kollagen I-lösning
Späd 0,575 ml isättika (17.4N) i 495 ml sterilt destillerat vatten (0,02 N slutlig koncentration). Sterilfiltrera utspädd ättiksyra med en 0,22 ^ m vacdem som vill ha filtreringssystem. Tillsätt 25 mg kollagen råttsvans I till utspädd ättiksyra till en slutlig koncentration av 50 pg / ml. Mängden kollagen tillsattes kommer att variera beroende på kollagen stamkoncentration. Lagra upp till en månad vid 4 ° C.
Framställning av kollagen I-belagda ytor vävnadsodlingsplattor
Ställe 1 ml kollagen I-lösning i varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta (använd 300 pl / brunn i 24-brunnars plattor, 3ml/25-cm 2 kolvar, och 8 ml/75-cm 2 kolvar). Inkubera 1 timme till över natten vid 37 ° C. Avlägsna kollagen I-lösningen och tvätta ytan två gånger, varje gång med PBS (använd 500 pl / brunn i 24-brunnsplattor, 2 ml / brunn i 6-brunnars plattor, 5ml/25-cm 2 kolvar, och 10 ml/75 -cm2 kolvar). Använd plattor omedelbart för cellodlingar.
FACS-färgning buffert
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 2% (vol / vol) fetalt bovint serum (FBS). Lagra up till 2 veckor vid 4 ° C.
A. ECFC Utväxt, kloning och expansion
- Samla CB med heparin (10 U heparin / ml blod) eller EDTA som antikoagulantia och transport till laboratoriet vid rumstemperatur och omedelbart (inom 2 timmar efter barnets leveransen) process provet för mononukleära celler (MNC) isolering.
- Alikvot 15 ml CB till varje 50-ml koniska centrifugrör och tillsätt 20 ml PBS till varje rör av CB och pipetten flera gånger för att blanda. Upprätta 15 ml Ficoll-Paque i en 20-ml spruta och bifoga en 20G nål eller blandning kanyl. Placera spetsen på kanylen blandning vid botten av röret av utspätt blod och noggrant underlagsmaterial 15 ml Ficoll-Pague. Centrifugera rören 30 min vid 740 x g vid rumstemperatur, utan den retardation broms.
- Med hjälp av en överföringspipett, ta bort den dimmiga skiktet av låg densitet multinationella befinner sig i gränsytan mellan Ficoll-Paque och utspädd plasma. Dispensera MNC i en 50-ml koniskt rör fortsaining 10 ml EGM-2-medium. Centrifugera MNC 10 min vid 515 x g vid rumstemperatur, med en hög retardation broms.
- Försiktigt aspirera och kasta supernatanten. Tvätta de pelleterade cellerna med EGM-2 två gånger (10 min vid 515 x g) och återsuspendera den MNC i EGM-2 vid 1,25 x 10 7 celler / ml. Framställa kollagen I belagda 6-brunnars vävnads-odlingsplattor genom tillsats av 1 ml rått-svans I kollagen typ (50 pg / ml) per brunn och inkubering av plattan under natten. Pipett 4 ml av denna suspension MNC i varje brunn och placera cellerna i 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator. A.1.5) Efter 24 timmar (dag 1), sakta ut det använda mediet (inte störa löst vidhäftande cellerna) från brunnen med en pipett, långsamt tillsätt 4 ml EGM-2 till brunnen, och återgå plattan i inkubatorn . På dag 2, uppdatera mediet genom att långsamt avlägsnande av mediet (inte stör de löst vidhäftande celler) från den brunn med en pipett och tillsätta 4 ml EGM-2 till varje brunn. Upprepa mediet ändras dagligen until dag 7 och varannan dag därefter fram ECFC kolonier visas för kloning. Vanligtvis kolonier visas mellan dag 5 och dag 14 dagar 7 (Fig. 1).
- Visualisera typiska ECFC kolonier med kullersten morfologi med användning inverterat mikroskop (förstoring 10x) och markera de kolonibildande gränser med en markör på undersidan av brunnen för att indikera positionen för varje koloni.
- På dag 14, tvätta dessa primära kolonier 2 gånger med PBS och skörda enskilda kolonier med kloning cylindrar och precis tillräckligt TrypLE uttrycklig för att täcka de celler inuti cylindrarna. Efter avsugning den sista tvätt av PBS, placera en steril gel belagd kloning cylindern runt varje koloni och tryck fast mot plattan med steril pincett. Tillsätt 2-3 droppar varmt TrypLE uttrycker in i varje cylinder kloning och inkubera under 3-5 min tills cellerna i cylindern börjar lossna. Tillsätt cirka 250 ^ il EGM-2-medium in i centrum av cylindern och pipettera upp och ner för att generate enkelcellsuspension. Överföra den enda cellsuspension från varje kloning cylindern separat i en individ mikro-centrifugrör.
- Tvätta området inom cylindern 2-3 gånger med ca 250 ^ EGM-2-medium för att samla alla kvarvarande celler och överföra tvätt från varje cylinder i respektive mikro-centrifugrör. Centrifugera cellerna vid hög hastighet (≤ 300 x g) för bordscentrifug under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1,5 ml färsk EGM-2-medium. Överföra cellsuspensionen (som innehåller alla celler från individuella kolonier) från varje rör i en brunn av en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta förbelagts med 500 | il råtta-svans kollagen I (50 | ig / ml).
- Rum inne i inkubatorn för expansion med media förändras utförs varannan dag.
- När cellerna närmar 80-90% konfluens, ta bort det använda mediet därefter tvätta cellerna 2 gånger med PBS och tillsätt 500 pl TrypLE uttryckliga medium till varje brunnav 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Placera plattan inne i inkubatorn under 3-5 minuter tills cellerna börjar samla ihop och ta. Tillsätt 1 ml av EGM-2 (med 10% definierat FBS) till varje brunn för att samla upp cellerna genom tvättning och överföra dem till en 15 ml-rör. Tvätta brunnen med 1 ml EGM-2-medium för att samla alla återstående celler och överföra tvättvätskan från varje brunn till respektive 15 ml-rör. Centrifugera cellerna vid 300 x g under 5 minuter.
- Avlägsna mediet och återsuspendera cellpelleten i 1 ml färsk EGM-2-medium (med 10% definierat FBS). Erhålla antalet viabla celler av en alikvot med användning av en hemacytometer och trypanblått-exklusion.
- Expandera cellerna genom ympning ca 5000 celler / cm 2 på ett kollagen I förbelagda vävnadsodlingsplattor ytor i EGM-2-medium med medium ändra varannan dag tills cellerna närmar 80-90% konfluens innan subodling på nytt.
B. In vitro Fenotypisk Karakterisering av ECFCs: Endothelial Cell Surface Antigen Expression end Single Cell Analys för klonal proliferativ potential
- För endotelcellernas ytantigen uttryck loss celler med TrypLE uttrycker att samla upp celler genom att använda metoder som beskrivs för ECFC kloning och expansion.
- Återsuspendera celler i FACS färgning buffert (10 x 10 6 celler / 1ml FACS färgningsbuffert) och tillsätt sedan FcR blockeringsreagens (20 pl / 10 x 10 6 celler), blanda försiktigt och lägg på is under 10 minuter.
- Alikvot 100 pl av denna cellsuspension i mikro-centrifugrör för varje endotelcell-ytantigen och kontroller isotyp. Lägg till lämplig mängd fluorokrommärkta humana monoklonala antikroppar som känner igen endotel antigener (CD31, CD144, CD146 och CD105) eller hematopoetiska antigener (CD45 och CD14) och lämna på is i 30 min skyddas från ljus Varning: 1 x 10 6 celler krävs inte för varje test. Författarna framställa typiskt 0,5 till 1 X 10 5 celler / rör för att erhålla 2 X 10 4 analyserad evenemang. Även följa tillverkarens rekommendation för den mängd antikroppar som ska användas för varje test. Vissa antikroppar kan kräva titrering för att bestämma den optimala koncentrationen av antikroppar. Allt färgning att författarna har utfört enda färg färgning.
- Efter 30 minuters inkubering på is centrifugeras varje rör med hög hastighet på en bordscentrifug under 5 minuter och avlägsna sedan supernatanten och återsuspendera cellpelleten i FACS-buffert.
- Proverna analyseras på en flödescytometer för att bestämma den procentuella andelen av celler som färgas positivt eller negativt för varje antigen. ECFCs färgning enhetligt positiva för CD31, CD144, CD146 och, men negativa för CD45 och CD14 jämfört med de motsvarande isotyp-kontroller.
- För enskild cell analys för att undersöka klonal proliferativ potential, ta bort tidig passage (2-3) celler med TrypLE uttrycker att samla upp celler med metoder liknande den som beskrevs för ECFC kloning och expansion.
- Infektera dessa cellermed förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) som uttrycker lentivirus 16 och samla celler som uttrycker EGFP med fluorescens-metri Varning:. Arbeta med lentivirus anses vara en biologiskt och alla bio-säkerhetsåtgärder bör följas.
- Kultur dem beskrivs som för odling ECFC i avsnittet om ECFC expansion.
- Framställ Kollagen I-belagda 96-brunnsplattor genom tillsats av 50 | il råtta-svans kollagen typ I (50 | ig / ml) per brunn och inkubera plattan över natten. Samla egfp + ECFCs med TrypLE express och återsuspendera dem i EGM-2 medium med slutlig koncentration ~ 10 6 celler / ml.
- Använda FACS Vantage (Becton Dickson) eller annan jämförbar sorterare med låg flödeshastighet av 20 celler per sekund för att sortera ett enda EGFP + ECFC per brunn av en 96-brunnsplatta och justera den slutliga volymen till 200 | il per brunn med EGM-2. Använda ett inverterat fluorescensmikroskop för att säkerställa att varje brunn erhöll endast en cell. AlternativEly, kan enskilda celler sorteras efter FSC och SSC och Sytox nukleära färgämne färgning kolonierna kan användas för cell poäng och kvantifiering.
- Inkubera plattan under en period av två veckor med två medier ändringar (200 pl EGM-2 med flerkanals pipett) som utförs på dag 5 och dag 10. På dag 14 av kulturen, tvättas varje brunn med 100 pl PBS innan fixering av cellerna med 100 | il av 4% paraformaldehyd under 30 minuter. För ECFCs som inte uttrycker EGFP, tillsätt Sytox reagens, en grönfluorescerande nukleär färg, efter paraformaldehyd fixering och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Använda ett fluorescensmikroskop för att undersöka varje brunn för att kvantifiera antalet endotelceller som expanderats från en enda cell, som odlats under 14 dagar. För kvantitativ analys, värdering brunnar med 2 eller fler endotelceller som positiv (för spridning) och undersöka dem vidare för totalt antal endotelceller genom visuell räkning med fluorescensmikroskop.
- För att visa than fick data, brunnar med endotelceller antal: 2 till 50, 51-2000, och 2001 eller mer, anses vara: endotelceller kluster, låg proliferativ potentiella (LPP)-ECFCs och hög proliferativ potential (HPP) - ECFCs respektive. ECFCs uppvisar fullständig hierarki av klonal proliferativ potential genom att ge upphov till endotelceller kluster, LPPS och HPPs när de odlas vid en enda cell nivå under 14 dagar. 7
C. In vivo funktionell karakterisering av ECFCs: In vivo kärlbildning analys för att undersöka ECFC potential för vaskulogenes
- Framställ cellularized implantat genom att beräkna den totala volymen (ml) av vardera av följande gelmaterial (med den slutliga koncentrationen i parentes) som krävs för att gjuta 1-ml gel (vilket kommer att senare halveras för att generera 2 implantat): FBS (10 %), EBM-2 10:01 (justera den slutliga volymen till 1 ml), natriumbikarbonat (1,5 mg / ml), NaOH (pH-justering till 7,4), HEPES (25 mM), fibronectin (100 pg / ml), och kollagen I (1,5 mg / ml).
- Efter gelmaterial beräkning loss celler med TrypLE uttrycker att samla upp celler med metoder liknande den som beskrevs för ECFC kloning och expansion. Erhålla en levande celler av en alikvot med användning av en hemacytometer och trypanblått. Överföra 2,4 miljoner livsdugliga celler i ett 50 ml koniskt rör och pelletera cellerna genom centrifugering vid 515 x g, rumstemperatur. Samtidigt förbereder gelmatrisen lösning genom att tillsätta beräknade volymer av HEPES, natriumbikarbonat, EBM-2 10:1, FBS, fibronektin och kollagen till en iskall 50-ml koniskt rör (i samma ordning som de listas). Blanda noggrant och justera pH till 7,4 med NaOH och samtidigt hålla lösningen på is.
- Kassera supernatant från cellerna efter centrifugering och åter-suspendera pelleten i 360 | il varmt EGM-2 och att det lägger till pH justerades 840 | il av gelmatrisen lösning, vilket gör den slutliga volymen av gelén implantatet 1 ml. Blanda cellerna i gelmatrisen lösningen långsamt tillsCellerna grundligt suspenderas i gellösningen.
- Överföra denna 1 ml cellularized gelsuspensionen till en brunn i en 12-brunnsvävnadsodlingsplatta och inkuberas under 20-30 min tills gelén polymeriserar. Försiktigt täcka gelén med 2 ml varmt EGM-2 och inkubera över natten.
- Omedelbart före implantationen, tudela över natten inkuberade gelén i två lika stora delar med hjälp av iris sax och tillbaka gel bitar att samma kultur och med EGM-2 medium.
- Använd djuret kirurgiska möjlighet att lugna djuret (5-6 veckor gamla NOD / SCID-möss) genom att administrera isoflurananestesi. Raka den nedre delen av buken och rengör den kirurgiska platsen med alkohol kuddar och Betadine eller antiseptisk. Sedan isolera området med draperier enligt lACUC och institutionella riktlinjer.
- Med användning av sterila skarpa iris sax för att göra en approximativt 5 mm snitt i den nedre kvadranten av bukhålan och exponerar det subkutana utrymmet mellan huden och bukmuskeln. Utför trubbig dissektion genom huden skiktet från buken muskler för att skapa en 15-20 mm bred ficka som leder överlägset i den övre delen av buken kvadranten. Upprepa förfarandet enligt skapa liknande öppen ficka i en annan sida av samma mus buken.
- Sätt en halv bit av gelén i en sida av buken ficka och en annan halv bit av gelén i en annan sida av den abdominala fickan genom att lyfta det dermala skiktet bara kaudalt om snittet.
- Efter införande av geler, stänga varje snitt med 2-3 stygn med 5-0 polypropylen sutur på en styckning nål. Lämpligt märka buren korten och utföra postkirurgisk övervakning och analgesi enligt de institutionella och protokoll krav och att 14 dagar för celler i dessa implanterade geler för att generera de novo kärlsystemet.
- Slutligen upptagning av implantat vanligen utförs 14 dagar efter implantation efter euthanizing musen.
- Tvätta buken med alkohol kuddar ochskära den abdominala huden kaudala till den ursprungliga inskärningslinjen. Noggrant, dissekera ut implantatet genom att skära ut en flik av huden kaudalt om sannolika läget i gelén. Excise implantatet genom att skära omkretsen runt gelén sedan plats i zink fixativ (BD Biosciences, följ tillverkarens rekommendation för optimala resultat) och låta dem fixa i 1-2 timmar vid rumstemperatur.
- Förbered paraffininbäddade geler med hjälp av vanliga histokemiska protokoll och förbereda 5 pm avsnitten på objektglas för att utföra färgning med hematoxylin och eosin, anti-human CD31 eller anti-mus CD31 att visualisera kärlen i gelén. ECFCs genomgå de novo vaskulogenes att generera humaniserade kärl i cellularized gel implantat sätts in immundefekta möss i 14 dagar 4,8,11.
D. Representativa resultat
Med hjälp av denna ECFC härledning teknik vi har observerat utanför tillväxt av primär koloni formenation så tidigt som dag 5 (figur 1). De ut-tillväxt ECFC kolonier visade typiska kullersten utseende och gav upphov till> 40 populationsfördubblingar vid långsiktig expansion efter koloni pickup genom kloning. Utökade kolonier uttryckte endotelceller antigener, men inte uttrycka hematopoetiska antigener (Fig. 2). Viktigare, visade de en fullständig hierarki av klonal proliferativ potential vid en enda cell nivå (fig. 3). Dessutom bildade ECFCs humaniserade blodkärl som genomströmmas med värd röda blodkropparna när de implanteras i immundefekta möss 4, 6, 8, 11 (Fig. 4).
Figur 1. Isolering av mononukleära celler (MNC) från navelsträngsblod och utväxt av endotelial kolonibildande celler (ECFCs) från odlade MNC. MNC formen lättcellskoncentratskiktet under FicoU-Pague densitetsgradientseparation av navelsträngsblodkroppar. Isolering av lättcellskoncentratskiktet till kulturen MNC på råtta-svans kollagen I belagda plattor resulterar i utväxt av ECFC koloni i 5 till 14 dagar. Utväxt ECFC koloni (indikerat med pilar) som visas kullersten morfologi 7.
Figur 2. Representativ in vitro fenotypisk bedömning av endotel-och hematopoetisk cell-ytantigen uttryck. Immunfenotypning av rep blodhärledda ECFCs avslöjade att ECFCs uttryckt endoteliala antigener CD31, CD34, CD144 och CD146, Flt-1, Flk-1, Flt-4, och Nrp2 men inte uttrycker hematopoetiska antigener CD45, CD14, CD11b, ckit, CXCR4 eller AC133 7, 8.
Figur 3. Representant in vitro kvantifiering av den klonogena och proliferativ potential CB härrör ECFCs. (A) navelsträngsblodHärrörande ECFCs visa klonal proliferativ potential med en hierarki av kolonier från kluster av 2-50 celler upp till kolonier av> 2001. (B) mikrofotografier av hierarki av kolonier (kolonier färgades med, Sytox, en grönfluorescerande nukleär färgämne för att ta bättre kvalitet bilder) som erhölls efter navelsträngsblod-härledd ECFCs odlades vid en enda cell nivå under 14 dagar. Skala stapel representerar 100 ^ 7, 8.
Figur 4. Representant i vivo funktionell karakterisering av härledda blod sladd ECFCs. A) H & E-färgning av navelsträngsblod-härledd ECFC innehållande cellularized implantat indikeras mikrokärl (fylld med värdens RBC)-bildning i kollagen-fibronektin-gel efter 14 dygn efter implanteringen. B) Anti-human CD31 färgning (brun färgning) bekräftar ytterligare mänskligt ursprung av dessa fartyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fenotypisk och funktionell karakterisering av förmodade endotelceller stamceller är det viktigt att identifiera de seriösa ECFCs som kan klonalt och seriellt Re-plating i kultur och ge upphov till långsiktiga och funktionella implanterbara blodkärl in vivo. Humant navelsträngsblod är berikad med ECFCs och koncentrationen av dessa cirkulerande celler minskar med åldrandet eller sjukdom 10. Nyligen genomförda studier tyder på att ECFC kan spela viktiga roller i vaskulär reparation eller regenerering i situationer med vaskulär skada, myokardiell infarkt, eller retinopati 17-19.
Här har vi beskrivit enkla och effektiva metoder för att härleda, kloning, expansion, och in vitro såväl som in vivo karakterisering av ECFCs från human navelsträng CB. Dessa metoder ge forskarna möjlighet att identifiera och isolera seriösa EPCs från CB som besitter klonal proliferativ potential och
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Dr Yoder är konsult EndGenitor Technologies, Inc. och ledamot i styrelsen för Rimedion Technologies, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
