Summary
Schistosoma mansoni-æg er potente stimulatorer af T-hjælpercelle type 2 (Th2) immunrespons, der er karakteristisk for parasit-infektion, astma og allergisk inflammation. Denne protokol anvender S. mansoni æg injektion til frembringelse af en CD4 Th2 cytokin-induceret inflammatorisk respons i lungerne, kendetegnet ved lunge granulomdannelse omkring ægget, eosinofili og makrofag alternativ aktivering.
Abstract
Schistosoma parasitter er blod ikter, der inficerer skønsmæssigt 200 millioner mennesker verden over 1.. Ved kronisk infektion med Schistosoma, den alvorlige patologi, herunder leverfibrose og splenomegali, er forårsaget af immunrespons parasitæg stedet parasitten selve 2. Parasitæg inducere et Th2-respons er kendetegnet ved produktion af IL-4, IL-5 og IL-13, den alternative aktivering af makrofager og rekrutteringen af eosinofiler. Her beskriver vi injektion af Schistosoma mansoni-æg som en model til at undersøge parasit-specifikke Th2 cytokin responser i lungen og drænende lymfeknuder, dannelsen af pulmonale granulomer omgiver ægget og luftvejsbetændelse.
Efter intraperitoneal sensibilisering og intravenøs udfordring, S. mansoni-æg transporteres til lungen via den pulmonale arterier, hvor de bliver fanget i lungeparenkymved granulomer sammensat af lymfocytter, eosinofiler og alternativt aktiverede makrofager 3-6. Forbundet med granuloma-dannelse, inflammation i broncho-alveolare rum, ekspansion af de drænende lymfeknuder og CD4 T-celleaktivering kan observeres. Her har vi detaljeret protokol for at isolere Schistosoma mansoni-æg fra inficerede levere (ændret fra 7), sensibiliserende og udfordrende mus, og udvinding af de organer (broncho-alveolær lavage (BAL), lunge-og drænende lymfeknuder) til analyse. Vi har også repræsentant histologisk og immunologiske data og forslag til yderligere immunologiske analyse.
Samlet Denne fremgangsmåde tilvejebringer en in vivo model til undersøgelse af helminth-inducerede immunologiske responser i lungen, som er bredt anvendelig til undersøgelse af Th2 inflammatoriske sygdomme, herunder helmint infektion, fibrotiske sygdomme, allergisk inflammation og astma. Fordele ved denne model til studiet af type to inflammation i lungen omfatter reproducerbarhed en potent Th2 inflammatorisk respons i lungerne og drænende lymfeknuder, den lette evaluering af inflammation ved histologisk undersøgelse af granulomer omkring ægget, og potentialet for langtidslagring af parasitten æg.
Protocol
1. Oprensning Schistosoma mansoni-æg
- Infect schweizisk-Webster-mus med schistosome cercariae, som er infektiøse stadium i Schistosoma livscyklus 8. Alternativt, få schistosome-inficerede mus fra NIAID Schistosomiasis Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Efterlade mus 6-7 uger efter infektion, på hvilket tidspunkt-punkt æg er til stede i leveren og kan udvindes som beskrevet nedenfor (se figur 1).
- Afliv mus med CO 2, og våd med 70% ethanol. Placer musen på bagsiden. Anvende stumpe forceps og saks til at skære huden og det underliggende peritoneum. Udskære leveren, placeret under brystkassen og membranen.
- Fint hakket lever og der tilsættes 20 ml pr leveren af fordøjelse blanding bestående af collagenase / dispase (0,5 mg / ml), penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 ug / ml) i PBS. Sæt mixture i et 50 ml Falcon-rør og inkuberes natten over i en 37 ° C-rysteapparat.
- Centrifugeres blandingen ved 400 xg / 3 min / 20 ° C. Forsigtigt hæld overskydende væske og fylde røret med PBS. Centrifugeres igen og gentag PBS vask. Efter sidste centrifugering, resuspender pelleten i 25 ml PBS.
- Si resuspenderede pellet gennem et standard køkken metallisk si (brug en 50 ml sprøjte stempel til mos leveren stykker gennem i et glas bægerglas), efterfulgt af passage af blandingen gennem en fin sigte (brug 10 ml sprøjte til at presse blanding gennem fin sigte i en anden bægerglas).
- Sættes belastede blanding i et 50 ml Falcon-rør. Der centrifugeres ved 400 xg / 5 min / 20 ° C. Omhyggeligt udøse supernatanten uden at miste bundfaldet. Resuspender pellet i 3 ml PBS.
- Overlejring blandes forsigtigt på en 20% Percoll og 40 ml gradient på 8 ml Percoll og 32 ml 0,25 M saccharose (FW = 342,3 således 8,56 g sucrose/100 ml H2O 0).
- Centrifugen 10 min / 800 xg / 20 ° C. Afpipetteres off end kassere gelatinøse øverste lag af leverceller. Fjerne ægget pellet ved bunden med en overførsel pipette og anbringes i en 15 ml Falcon-rør.
- Vask bundfaldet 3X i 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA ved hjælp centrifugerør indstillinger: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Resuspender i 500 pi PBS.
- Overlejring bland på en ny 25% Percoll og 10 ml-gradient (2,5 ml Percoll og 7,5 ml 0,25 M saccharose) under anvendelse af centrifugering indstillinger: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
- Vaskes 3X i 10 ml PBS med centrifuge indstillinger: 3 min / 30 xg / 20 ° C.
- I de sidste 10 ml vask, fjerne 100 pi at tælle æg. Æg bosætte sig hurtigt, så Falcon røret skal blandes godt, før du fjerner prøve. Fortynd 100 pi prøve med 900 pi PBS. 100 pi af blandingen skal tælles som dråber på et objektglas under anvendelse af et dissektionsmikroskop (1:10 fortynding). Stor indvendig diameter pipettespidser skal anvendes.
- Resuspender æg på 50.000 æg / ml i PBS. Æg kan opbevares i adskillige måneder ved -80 ° C og optøet en gang eller twice til brug. Før brug, inspicere under et mikroskop for at sikre, at æggene er stadig intakt (se fig. 1).
2. Intraperitoneal Sensibilisering med S. mansoni Æg: Dag 0
- Forberede æg ved 5.000 eggs/100 pi PBS i en 5 ml snapcap rør. For injektion, vurderer 50% flere æg end nødvendigt.
- Indlæse en 23 gauge 3/4inch nål og en 1 ml sprøjte med 100 pi æg suspension pr mus. Æg sig, så belastningen nål med æg umiddelbart inden brug.
- Sten sprøjte frem og tilbage for at blande æg før hver injektion og injicere intraperitonealt 100 pi af suspensionen pr mus.
3. Retro-orbital intravenøs Challenge med S. mansoni Æg: Dag 14
- Forbered æg som ovenfor ved 5.000 eggs/100 pi.
- Bedøve mus i specialiserede kammer med isofluran (4%) eller intraperitonealt med xylazin (10 mg / kg) og ketamin (120 mg / kg). Dybde af Anesthesia bestemmes ved at klemme af trædepuden og sikre ingen fysisk reaktion.
- Efter fyldning af 1 ml sprøjte og 23 gauge 3/4inch nål med æg, pincet brug at bøje nålen i en 90 ° vinkel med det koniske nedad i vinkel. Sørg for, at der ikke er luftbobler.
- Anbring mus på den ene side. Tilbagetrukne huden, så øjet vil rage og injicere 100 uL i karrene bag øjeæblet i en 45 ° vinkel i forhold til næsen.
- Træk nålen, og et let tryk for at kontrollere blødning.
Alle disse procedurer skal udføres med omhu, og musene skal overvåges, indtil de komme fra bedøvelsen. Disse protokoller blev godkendt af University of Pennsylvania Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC).
4. Eksperimentel Høst: Dag 22
- Afliv mus med CO 2.
- Våd mus med 70% ethanol, og sted på ryggen.
- Ved stump Forceps, fat i musen maven og lave et lille snit i huden. Fjern forsigtigt huden med en saks og eksponere brystkassen og bughinden.
- Skær åbne bughinden. Skær den abdominale aorta at genvinde blodet med en Pasteur-pipette. Opbevar på is.
- Flyt leveren ned til eksponere mellemgulvet. Brug fine saks til at klippe mellemgulvet. Skær forsigtigt åbne brystkassen for at eksponere lungevævet.
- Inddrive de parathymic lymfeknuder, der dræner lungerne med fine pincet. Disse gemt under brystkassen, på hver side af thymus 9. Opbevar på is i 1 ml sterilt medium (DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-mercaptoethanol, alle tilgængelige fra Invitrogen).
- For at genvinde BAL, og puste lungerne til histologisk analyse, skal intratrakeal intubation foretages. Blotlægge trachea ved at bevæge spytkirtler til siden, og placing fine tang under luftrøret. Ved hjælp af fine sakse, et hul skåret i midten af trachea, og indsætte røret i lungerne. Fastgør slangen ved at binde med kirurgisk tråd.
- Vedhæfte PBS fyldt 1 ml sprøjte til røret og oppustes lunger med 1 ml PBS. Forsigtigt hente BAL vask med sprøjte. Opbevar på is.
- Vedhæfte 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS-fyldes 1 ml sprøjte til røret og pump lungerne.
- Fjern slangen, og spænd det kirurgiske tråden for at forhindre lækage af PFA.
- Omhyggeligt dissekere ud lungevæv og anbringes i et 50 ml Falcon-rør med 5 ml 4% PFA.
5. Udarbejdelse af Gendannede Væv
- Serum: Efter opbevaring på is i 30 minutter til 2 timer for blod til at størkne, er serum udvindes fra blodet ved centrifugering (13000 x g / 10 min / 4 ° C). Serum lagres ved -20 ° C og kan anvendes til cytokin ELISA'er eller S. mansoni æg antigen-specifik IgG-isotypen ELISA'er
- Lymfeknuder: Enkelt-celle suspensioner fremstilles og celletællinger anvendt til at evaluere størrelsen af immunresponset. At undersøge Th2-celleaktivitet polarisering celler restimuleres med S. mansoni æg antigen i 72 timer. Intracellar cytokin-farvning kan undersøges ved flowcytometri, og supernatanterne kan udvindes og opbevares ved -20 ° C i ELISA af Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-13) 6.
- BAL: Celler pelleteres (400 x g / 5 min / 4 ° C). BAL-væsken udvindes og opbevares ved -20 ° C til analyse af Th2-cytokiner ved ELISA. BAL-celler tællinger anvendes som en udlæsning for luftvejsinflammation. Cytocentrifuge præparater 10.000-100.000 celler (500 rpm / 5 min / 4 ° C), vil efterfulgt af Diffquik farvning tillade tælling af inflammatorisk infiltrat 4, 6. Alternativt kan BAL-celler undersøges ved flowcytometri 6.
- Lungevæv: Lungevæv er lagringED natten over ved 4 ° C. Fikseret væv er paraffin-indlejret, snit og monteret på objektglas til histologisk og immunofluorescens-analyse.
6. Repræsentative resultater
Denne protokol detaljer alle de nødvendige skridt til (i) udarbejde rensede Schistosoma mansoni-æg til in vivo brug (fig. 1), (ii) bevidstgøre og udfordre mus med disse æg og (iii) at geninddrive organer til undersøgelse af lunge-inflammatoriske respons. Denne in vivo-model reproducerbart driver en potent Th2 lunge inflammatorisk respons. Dette er vist ved luftvejsinflammation og eosinofili, som visualiseres ved BAL celletal og cytocentrifuge præparater (fig. 2). H & E-farvede lungesnit kan undersøges for æg-induceret granulomer (fig. 3a), og immunofluorescens-farvning af lungesnit tillader visualisering af alternativt aktiverede makrofager og Th2 cytokin-inducerede gener, såsom resistenstin-lignende molekyle (RELM) α (fig. 3b). Den antigen-specifikke CD4 Th2 cytokin respons undersøgt ved ELISA for IL-5, IL-4 og IL-13 af antigen-stimulerede parathymic lymfeknudeceller (fig. 4).
Figur 1 Schistosoma mansoni æg injektion model Repræsentative billeder af granulomatøse lever, der er karakteristiske for høje S.mansoni-æg byrder, og af S.mansoni æg vises -.. Gennemsnitlige størrelse (L) 120 um (W) 50 um.
Figur 2. S. mansoni æg injektion driver luftvejene. A. BAL celleantal (x10 5) fra naive (N) eller S.mansoni (Sm) ægge-injicerede mus. * P <0,05. B. cytocentrifuge fremstilling af BAL-celler. Mac, Makrofag; Eos, eosinofil, lymfe, lymfocyt. Bar, 10 um.
Figur 3. Visualisering af pulmonære granulomer og alternativt aktiverede makrofager, der omgiver S.mansoni ægget. A. Pulmonal granulom omgiver Sm ægget (sorte pil) blev visualiseret i H & E-farvede lungesnit. B. Immunfluorescensfarvning af RELMα (grøn), mannose-receptor (rød) og DAPI (blå) viser alternativt aktiverede makrofager (hvid pil) i granuloma omgiver autofluorescerende Sm ægget (sort pil). Bar, 50 um.
Figur 4. S.mansoni æg antigenspecifik Th2 cytokin respons. Tappe parathymic lymfeknudeceller fra naive (N) eller Sm æg-injicerede mus blev stimuleret med Sm </ Em> æg antigen i 72 timer efterfulgt af ELISA af supernatanter for IL-4, IL-5 og IL-13. Skala ng / ml. * P <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er en model anvender Schistosoma mansoni-æg at inducere type 2 lungeinflammation beskrevet. Karakteristiske træk ved denne model omfatter potente Th2-immunrespons, luftvejsinflammation og pulmonær granuloma-dannelse. Eftersom disse parametre afhænger CD4 Th2-celle-responser 11, er en nyttig model til at undersøge virkningerne af protein-specifikke eller slægt-specifikke deletioner i Th2-celle-responser. Her udlæsninger omfatter kvantificering af antigen-specifikke Th2-cytokiner, analyse af celleinfiltration i luftvejene, og størrelsen af de pulmonale granulomer. En yderligere parameter, der kan måles, er ægge-induceret fibrose 12. Dette måles ved farvning af æg-injicerede lungesnit med Massons trichrom, hvilket muliggør visualisering af kollagenaflejring, der opstår omkring beholderne, luftvejene og i granuloma (vist i seks).
Selvom denne protokolol beskæftiger S. mansoni æg, en begrænsning af denne model er, at den ikke gengiver S. mansoni infektion, som udføres ved at inficere mus med infektiøs cercariae. Imidlertid fordele ved denne model er behageligere for oprettelse, og at der ikke er risiko for infektion af undersøgeren. Efter rensning, kan æggene bekvemt fryses og bruges flere måneder senere. Når optøet, æggene ikke er infektiøse, og kan derfor håndteres lettere end levende æg, eller smitsomme cercariae. Ved udarbejdelsen af æg til injektion, må man sørge for, at æggene er intakt ved inspektion under mikroskop. For at minimere æg afbrydelser, bred løb pipettespidser og nåle skal anvendes ved håndtering, og pipettering af æg når det er nødvendigt. Siden æg bosætte sig hurtigt, er det også kritisk at re-suspendere ved forsigtig vuggende før tælle eller injektion.
Selvom de rensede æg kan fryses, skal smittede lever behandlesumiddelbart efter en vellykket oprensning af æg. Idet alvoren af infektionen, og antallet af æg er til stede i leveren, er musestamme-afhængige, vil tidspunkter for æg genvinding og æg udbytter varierer afhængig af de anvendte mus. Her Schweiz Webster hunner blev anvendt, og aflivet ved 6-7 uger efter infektion til generering af 10,000-30,000 æg / lever. Som en nyttig reference, Cheever et al. detaljeret leveren æg byrder i flere musestammer 13.
Egg injektion inducerer ikke dødeligheden. Dog kan mus bukke under, hvis over-bedøvet, hvis ægget præparatet ikke vaskes grundigt (som beskrevet i protokollen), eller hvis æg injektion forårsager alvorlige blødninger. Et alternativ til retro-orbital injektion haleveneinjektion af æggene. Dette resulterer også i en potent æg-induceret lunge inflammatorisk respons 3. Alle disse procedurer skal udføres med omhu, og musene skal overvåges, indtil de komme fra bedøvelsen.
Som konklusion, denne protokol detaljer injektion af S. mansoni-æg til induktion af lungeinflammation og Th2-celle responser og kan anvendes til studiet af helminth-induceret inflammation, astma, allergi og fibrotiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) AI091759 og Crohns og Colitis Foundation of America 's William og Shelby Modell Family Foundation Research Award (til MN). Schistosome-inficerede mus blev leveret af NIAID Schistosome Resource Center (NIAID Kontrakt N01 A130026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase/Dispase | Roche Applied Science | 11 097 113 001 (500mg) | |
| Diff Quik Hema 3 Stain | Pack | Fisher Scientific Co. LLC | 122-911 |
| DMEM | Liquid | Gibco | 11965 |
| Falcon 50mL | Pack | Falcon | 352070 |
| Intramedic PE Tubing | Becton Dickinson and Co. | 427410 (0.58mm) | |
| Isoflurane | Abbot Animal Health | 52600405 (250mL) | |
| Ketamine | Fort Dodge, Animal Health | 100mg/mL | |
| Mannose receptor antibody | Biotin | AbD Serotec | MCA2235B |
| Metallic Strainer | Standard kitchen strainer | Target | Laurentiis |
| Paraformaldehyde | Electron Microsc. Sciences | 15710 (16%) | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | 15070 (100x) | |
| Percoll | GE Healthcare Biosciences | 17 0891 01 (1 Liter) | |
| RELMα antibody | Peprotech | 500-P214 (50μg) | |
| Surgical Thread | Surgical Specialties Corp. | SP118 (2.0 USP 100yds) | |
| Syringe Needle | BD Vacutainer Lab. Med. | 305143 (23g, 3/4 inch) | |
| USA Standard Testing Sieve | W.S. Tyler, Inc. | 150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100 |
|
| Xylazine | Butler | 20mg/mL |
References
- World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. WHO Technical Report Series 912. , Geneva. (2002).
- Pearce, E. J., MacDonald, A. S. The immunobiology of schistosomiasis. Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).
- Sandler, N. G. Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair. J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).
- Perrigoue, J. G. IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).
- Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses. Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).
- Nair, M. G. Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).
- Dalton, J. P. A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues. Parasitology. 115, 29-32 (1997).
- Lewis, F. A. Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations. J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19 (2001).
- Kaplan, M. H. Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response. J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).
- Cheever, A. W. Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni. Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).
