Använda ägg från Published: June 5, 2012 doi: 10.3791/3905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Karen L. Joyce¹, Will Morgan², Robert Greenberg², Meera G. Nair¹

¹Institute of Immunology, Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Schistosoma mansoni ägg är potenta stimulatorer av T-hjälpar typ 2 (Th2) immunsvar som är karakteristisk för parasitinfektion, astma och allergisk inflammation. Detta protokoll använder S. mansoni ägg injektion för att generera en CD4 Th2-cytokin-inducerad inflammatorisk respons i lungorna, som kännetecknas av lungan granulombildning runt äggets, eosinofili och makrofag alternativ aktivering.

Abstract

Schistosoma parasiter är blodmaskar som infekterar uppskattningsvis 200 miljoner människor världen över ^1. Vid kronisk infektion av Schistosoma, den allvarliga sjukdomstillstånd, inklusive leverfibros och splenomegali, orsakas av immunsvaret mot parasiten ägg snarare än själva parasiten ^2. Parasit ägg inducera en Th2-respons kännetecknas av produktion av IL-4, IL-5 och IL-13, den alternativa aktivering av makrofager och rekryteringen av eosinofiler. Här beskriver vi injektion av Schistosoma mansoni ägg som en modell för att undersöka parasit-specifika Th2 cytokin svar i lungan och dränerande lymfkörtlar, bildandet av pulmonella granulom som omger ägget och luftvägsinflammation.

Efter intraperitoneal sensibilisering och intravenös utmaning, S. mansoni ägg transporteras till lungorna via lungartärerna där de fångade i lungparenkymmed granulom består av lymfocyter, eosinofiler och alternativt aktiverade makrofager ^3-6. Associerad med granulombildning, inflammation i bronko-alveolära utrymmena, T-cellaktivering expansion av de dränerande lymfkörtlarna och CD4 kan observeras. Här har vi detalj-protokollet för att isolera Schistosoma mansoni ägg från infekterade lever (modifierad från ^7), sensibiliserande och utmanande möss och utvinna de organ (bronko-alveolära lavage (BAL), lung-och dränerande lymfkörtlar) för analys. Vi inkluderar även representativa histologisk och data immunologiska och förslag för ytterligare immunologisk analys.

Totalt sett ger denna metod en in vivo modell för att undersöka helmint immunologiskt svar i lungan, som är brett tillämpbar på studiet av Th2 inflammatoriska sjukdomar inklusive helmintinfektion fibrotiska sjukdomar, allergisk inflammation och astma. Fördelar med denna modell för att studera type 2 inflammation i lungan innefattar reproducerbarheten av en potent Th2 inflammatorisk respons i lungorna och dränerande lymfkörtlar, lättheten för bedömning av inflammation genom histologisk undersökning av de granulom omger ägget, och potentialen för långtidslagring av parasiten ägg.

Protocol

1. Purifying Schistosoma mansoni Ägg

1. Infektera schweiziska Webster-möss med Schistosome cercariae, vilket är det infektiösa stadiet i Schistosoma livscykel ^8. Alternativt kan få Schistosome-infekterade möss från NIAID Schistosomiasis Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Lämna möss 6-7 veckor efter infektion, då-punkt, ägg finns i levern och kan återvinnas som beskrivs nedan (se figur 1).
2. Euthanize möss med CO _2, och blöta med 70% etanol. Placera musen på baksidan. Använd trubbiga pincett och sax för att skära bort huden och underliggande bukhinnan. Excidera levern, belägen under bröstkorgen och bländare.
3. Fint mala levrar och tillsätt 20 ml per lever hos digerering blandning, som består av kollagenas / dispas (0,5 mg / ml), penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 pg / ml) i PBS. Sätt blandnure i en 50 ml Falcon-rör och inkuberas över natten i en 37 ° C skakare.
4. Centrifugera blandningen vid 400 xg / 3 min / 20 ° C. Försiktigt hälla av överskott av vätska och fylla röret med PBS. Centrifugera igen och upprepa PBS tvätt. Efter sista centrifugeringen, resuspendera pelleten i 25 ml PBS.
5. Sila återsuspenderade pelleten via en vanlig kök metall sil (använd en 50 ml spruta kolven för att mosa lever bitarna igenom i en glasbägare), följt av att passera blandningen genom en fin sil (använd 10 ml spruta för att driva blandningen genom den fina sikten in i en andra glasbägare).
6. Sätt ansträngd blandningen i en 50 ml Falcon-rör. Centrifugera vid 400 xg / 5 min / 20 ° C. Häll försiktigt ut supernatant utan att förlora pellet. Återsuspendera pelleten i 3 ml PBS.
7. Överlagringen blanda försiktigt på en 20% PercoU, 40 ml gradient av 8 ml Percoll och 32 ml 0,25 M sackaros (FW = 342,3 så 8,56 g sucrose/100 ml H ₂ 0).
8. Centrifiigera 10 min / 800 x g / 20 ° C. Pipettera av end kassera gelatinös toppskikt av leverceller. Ta bort ägg pellet på botten med en överföringspipett och placerades i ett 15 ml Falcon rör.
9. Tvätta pelleten 3X i 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA användning inställningar centrifugrör: 3 min / 30 OOOxg / 20 ° C. Återsuspendera i 500 | il PBS.
10. Overlay mix på en ny 25% Percoll, 10 ml gradient (2,5 ml Percoll och 7,5 ml 0,25 M sackaros) med hjälp av centrifuger inställningar: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
11. Tvätta 3X med 10 ml PBS med användning av centrifug-inställningar: 3 min / 30 OOOxg / 20 ° C.
12. Under de senaste 10 ml tvätt, ta bort 100 pl att räkna ägg. Ägg lösa snabbt, så Falcon röret måste blandas väl innan du tar bort prov. Späda ut 100 | il prov med 900 | il PBS. 100 | il av blandningen bör räknas som droppar på ett objektglas med användning av ett dissekerande mikroskop (1:10 utspädning). Med stor diameter pipettspetsar bör användas.
13. Återsuspendera ägg på 50.000 ägg / ml i PBS. Ägg kan lagras under flera månader vid -80 ° C och tinades en gång eller TWICe för användning. Före användning, kontrollera under ett mikroskop för att se till att äggen är fortfarande intakta (se figur 1).

2. Intraperitoneal Sensibilisering med S. mansoni Ägg: Dag 0

1. Framställ ägg vid 5000 eggs/100 il PBS i en 5 ml snapcap röret. För injektion uppskattar 50% fler ägg än nödvändigt.
2. Ladda en 23 gauge nål ^3/4inch och en 1 ml spruta med 100 | il av suspensionen ägg per mus. Ägg lösa, så belastningen nål med ägg omedelbart före användning.
3. Rock sprutan fram och tillbaka för att blanda ägg före varje injektion och injicera intraperitonealt 100 pl suspension per mus.

3. Retro-orbital intravenös Challenge med S. mansoni Ägg: Dag 14

1. Förbered ägg enligt ovan vid 5.000 eggs/100 il.
2. Bedöva möss i specialiserad kammare med isofluran (4%) eller intraperitonealt med xylazin (10 mg / kg) och ketamin (120 mg / kg). Djup för Anesthesia bestäms genom att klämma på trampdynan och säkerställa ingen fysisk svar.
3. Efter laddning av 1 ml spruta och 23 gauge nål ^3/4inch med ägg, använda pincetter för att böja nålen vid en 90 ° vinkel med det koniska riktade nedåt i vinkel. Se till att inga bubblor finns.
4. Placera musen på ena sidan. Dra tillbaka huden så ögat kommer att skjuta ut, och injicera 100 jil i kärlen bakom ögongloben vid en 45 ° vinkel mot näsan.
5. Dra nålen och applicera lätt tryck för att kontrollera blödning.

Alla dessa förfaranden måste utföras med omsorg, och möss måste övervakas tills de återhämta sig från anestesi. Dessa protokoll godkändes av University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (lACUC).

4. Experimentell Harvest: Dag 22

1. Euthanize möss med CO _2.
2. Våt mus med 70% etanol, och lägg på rygg.
3. Med hjälp av trubbig konstruktöeps, ta tag i musen buken och gör ett litet snitt i huden. Ta försiktigt bort hud med sax och exponera bröstkorgen och bukhinna.
4. Skär upp bukhinnan. Skära den abdominala aortan för att återvinna blod med en Pasteur-pipett. Förvara på is.
5. Flytta levern ned för att exponera membranet. Använd fina sax för att klippa membranet. Noggrant kapas öppen bröstkorg för att exponera lungvävnad.
6. Återvinna parathymic lymfkörtlar som dränerar lungan med fin pincett. Dessa flikar är instoppade under bröstkorgen, på vardera sidan av tymus ^9. Förvara på is i 1 ml sterilt medium (DMEM kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 50 | iM 2-merkaptoetanol, alla tillgängliga från Invitrogen).
7. Att återvinna BAL och blåsa lungorna för histologisk analys måste intratrakeal intubering utföras. Exponera luftstrupen genom att flytta spottkörtlarna åt sidan, och placing fin pincett under luftstrupen. Användning av fina saxar, skärs ett hål i mitten av luftstrupen och sätt slangen in i lungorna. Fast slangen genom att binda med kirurgisk tråd.
8. Fästa PBS-fylld 1 ml spruta för att slangen och blåser lungorna med 1 ml PBS. Noggrant hämta BAL tvätt med spruta. Förvara på is.
9. Fästa 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS-fylld 1 ml spruta till slangen och blåsa i lungorna.
10. Ta bort slangen och dra åt den kirurgiska tråden för att förhindra läckage av PFA.
11. Dissekera försiktigt ut lungvävnad och placera i ett 50 ml Falcon-rör med 5 ml 4% PFA.

5. Beredning av Återvunna vävnader

1. Serum: Efter lagring på is under 30 minuter till 2 timmar för blodet att koagulera, i serum utvinns från blodet genom centrifugering (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Serum förvarades vid -20 ° C och kan användas för cytokin ELISA eller S. mansoni ägg antigen-specifika IgG-isotyp ELISA
2. Lymfknutor: Enkelcellsuspensioner framställes och cellräkningar användes för att utvärdera omfattningen av immunsvaret. För att undersöka Th2 celler polarisering, cellerna på nytt stimulerade med S. mansoni ägg antigen för 72 timmar. Intracellar cytokinfärgning kan undersökas genom flödescytometri, och supernatanter kan utvinnas och lagras vid -20 ° C under ELISA av Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: Celler pelleteras (400 x g / 5 min / 4 ° C). BAL-vätskan uppsamlas och förvaras vid -20 ° C för analys av Th2-cytokiner genom ELISA. BAL cellräkning används som en utläsning för luftvägsinflammation. Cytocentrifug beredningar av 10.000-100.000 celler (500 rpm / 5 min / 4 ° C), kommer följt av färgning Diffquik tillåta räkning av inflammatoriskt infiltrat ^{4, 6.} Alternativt kan BAL-celler undersökas av flödescytometri ^6.
4. Lungvävnad: Lungvävnad är Storred över natten vid 4 ° C. Fixerad vävnad är paraffininbäddade, sektionerades och monterades på objektglas för histologisk och immunfluorescensanalys.

6. Representativa resultat

Detta protokoll beskrivs alla nödvändiga åtgärder för att (i) förbereder renat Schistosoma mansoni ägg för användning in vivo (Fig. 1), (ii) utlösa och utmana möss med dessa ägg och (iii) driva organ för granskning av lungan inflammatoriska svaret. Detta in vivo-modell driver reproducerbart en potent Th2 lung inflammatoriskt svar. Detta framgår av luftvägsinflammation och eosinofili som visualiseras genom BAL celltal och preparat cytocentrifug (Fig. 2). H & E-färgade sektioner lung kan undersökas för ägg-inducerade granulom (fig 3a), och immunofluorescerande färgning av lungsnitt tillåter visualisering av alternativt aktiverade makrofager och Th2-cytokin-inducerade gener såsom motståndtenn-liknande molekyl (Relm) α (fig. 3b). Den antigen-specifika CD4-Th2-cytokin svar undersöks genom ELISA för IL-5, IL-4 och IL-13 av antigen-stimulerade parathymic lymfkörtelceller (fig. 4).

Figur 1 Schistosoma mansoni ägg injektion modellen Representativa bilder av granulomatös levrar, karaktäristiska höga S.mansoni-ägg bördor, och av S.mansoni ägg visas -.. Genomsnittliga storlek (L) 120 m från (W) 50 pm.

Figur 2. S. mansoni ägg injektion driver luftvägsinflammation. A. BAL cellantal (x10 ⁵⁾ från naiva (N) eller S.mansoni (Sm) ägg injicerade möss. * P <0,05. B. cytocentrifug beredning av BAL-celler. Mac, Makrofag; Eos, eosinofil; lymfa, lymfocyt. Bar, 10 | im.

Figur 3. Visualisering av pulmonella granulom och alternativt aktiverade makrofager som omger S.mansoni ägget. A. Pulmonell granulom omger ägget Sm (svart pil) visualiserades i H & E-färgade sektioner lungfibroblaster. B. Immunfluorescens färgning för RELMα (grön), mannos-receptorn (röd) och DAPI (blått) avslöjar alternativt aktiverade makrofager (vita pilar) i granulom omger autofluorescerande Sm ägget (svart pil). Bar, 50 | im.

Figur 4. S.mansoni ägg antigenspecifik Th2-cytokin respons. Avtappning parathymic lymfkörtelceller från naiva (N) eller Sm ägg-injicerade möss stimulerades med Sm </ Em> ägg antigenet under 72 timmar, följt av ELISA för supernatanter som för IL-4, IL-5 och IL-13. Skala, ng / ml. * P <0,05.

Discussion

Här är en modell som använder Schistosoma mansoni ägg för att framkalla typ 2 lunginflammation beskrivits. Kännetecknen för denna modell inkluderar potent Th2 immunsvar, luftvägsinflammation och pulmonell granulombildning. Eftersom dessa parametrar är beroende av CD4 Th2-cellsvar ^11, är detta en användbar modell för att undersöka effekterna av protein-specifika eller härkomstspecifik deletioner på Th2-cellsvar. Här avläsning skulle omfatta kvantifiering av antigen-specifika Th2 cytokiner, analys av cellinfiltration i luftvägarna, och storleken på lung granulom. En ytterligare parameter som kan mätas är ägg-inducerad fibros ^12. Detta mäts genom färgning ägg injicerade lungsektioner med Massons trikrom, som tillåter visualisering av koUagendeposition som inträffar omgivande kärlen, luftvägarna och inom granulom (visad i ^6).

Även om detta protokollol utnyttjar S. mansoni ägg, en begränsning av denna modell är att den inte återger S. mansoni infektion, vilket utförs genom att infektera möss med infektiös cercariae. Emellertid är fördelarna med denna modell bekvämligheten för att upprätta, och att det inte finns någon risk för infektion av undersökaren. Efter rening kan äggen lämpligen frysas och användes flera månader senare. När tinats, äggen inte är smittsamma och kan därför hanteras lättare än levande ägg, eller smittsam cercariae. När man förbereder ägg för injektion, måste man se till att äggen är hela genom inspektion under mikroskop. För att minimera ägg störningar, brett lopp pipettspetsar och nålar måste användas vid hantering och pipettering av ägg endast vid behov. Eftersom ägg sedimenterar snabbt, är det också kritiskt att återsuspendera genom försiktig skakning före räkning eller insprutning.

Även om de renade ägg kan frysas, måste infekterade lever behandlasomgående för framgångsrik rening av ägg. Eftersom graden av infektion, och antalet ägg som finns i levern är musstammen-beroende, kommer de tids-poäng för ägg återhämtning och ger ägg varierar beroende på de använda möss. Här schweiziska Webster honor användes, och offrades vid 6-7 veckor efter infektion för generering av 10,000-30,000 ägg / lever. Som en användbar referens, Cheever et al. detalj bördor levern ägg i flera musstammar ^13.

Egg injektion inducerar inte dödlighet. Dock kan mössen ge efter om det över-bedövade, om ägget preparatet inte tvättas ordentligt (enligt beskrivningen i protokollet) eller om ägget injektion orsakar svår blödning. Ett alternativ till retroorbital injektion är svansveninjektion av äggen. Detta resulterar också i en potent ägg-inducerad lungcancer inflammatoriskt svar ^3. Alla dessa förfaranden måste utföras med omsorg, och möss måste övervakas tills de återhämta sig från anestesi.

Sammanfattningsvis detta protokoll detaljer injektion av S. mansoni ägg för induktion av lunginflammation och Th2-svar cell, och gäller för studier av inälvsmask-inducerad inflammation, astma, allergi och fibrotiska sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase/Dispase		Roche Applied Science	11 097 113 001 (500mg)
Diff Quik Hema 3 Stain	Pack	Fisher Scientific Co. LLC	122-911
DMEM	Liquid	Gibco	11965
Falcon 50mL	Pack	Falcon	352070
Intramedic PE Tubing		Becton Dickinson and Co.	427410 (0.58mm)
Isoflurane		Abbot Animal Health	52600405 (250mL)
Ketamine		Fort Dodge, Animal Health	100mg/mL
Mannose receptor antibody	Biotin	AbD Serotec	MCA2235B
Metallic Strainer	Standard kitchen strainer	Target	Laurentiis
Paraformaldehyde		Electron Microsc. Sciences	15710 (16%)
Penicillin/ Streptomycin		Gibco	15070 (100x)
Percoll		GE Healthcare Biosciences	17 0891 01 (1 Liter)
RELMα antibody		Peprotech	500-P214 (50μg)
Surgical Thread		Surgical Specialties Corp.	SP118 (2.0 USP 100yds)
Syringe Needle		BD Vacutainer Lab. Med.	305143 (23g, 3/4 inch)
USA Standard Testing Sieve		W.S. Tyler, Inc.	150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100
Xylazine		Butler	20mg/mL