热酚水提取纯化及革兰氏阴性菌脂多糖的可视化

Summary

我们描述一个净化革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的修改热水溶液中苯酚的提取方法。一旦提取，内毒素可随后通过SDS-PAGE分析，并通过可视化的直接染色或西方免疫。

Abstract

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分。这是一个劳，资及政府三方代表组成的脂质分子组成，这是嵌入在外膜，核心寡糖和重复单位向外延伸，从表面的细胞^1，2 O-抗原。 LPS是一种免疫分子的毒力和发病机制中的许多种细菌，包括绿脓杆菌，沙门氏菌和大肠杆菌 ^3-5，LPS O-抗原组成形式株血清型分型的基础上的差异是很重要的。脂多糖在附件涉及申办开始在感染的细胞和补体介导的杀戮提供保护;缺乏内毒素的菌株可能是致病的减毒^6-8。由于这些原因，重要的是脂多糖，可视化，尤其是从临床分离。带特定A模式和识别的可视化脂多糖ntibodies可以成为有用的工具，识别应变谱系和各种突变体的特点。

在这份报告中，我们描述为革兰氏阴性细菌细胞内毒素的分离和净化水热酚法。该协议允许提取脂多糖远离核酸和蛋白质，可以干扰可视化与内毒素，发生时间较短，较不密集的提取方法^9。脂多糖准备，这种方式可以通过十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和直接使用碳水化合物/糖蛋白污渍或标准的银染方法染色分开。许多抗血清对LPS含有抗体的交叉反应与外膜蛋白或其他抗原的目标，可以阻碍粗细胞裂解物的SDS-PAGE分隔后，西方免疫反应观察。原油单细胞裂解蛋白酶处理并不总是一个有效的方式消除这种背景使用或其他可视化方法。此外，在试图消除这种背景下广泛的蛋白酶处理可能导致质量低劣，没有很好地解决上述任何一种方法的毒素。由于这些原因，我们认为以下协议，从Westpahl和Jann ¹⁰改编，是理想的毒素提取。

Protocol

1。细菌脂多糖提取制备

1. 开始卢里亚肉汤（LB），如果有必要用抗生素，辅以在5毫升过夜培养。成长培养过夜（12-18小时），用颤抖的孵化器，在37°C和200转。
2. 与LB培养基1:10稀释，并采取OD ₆₀₀分光光度计阅读。外径₆₀₀阅读的基础上，作出了你的细菌悬浮液1.5毫升到0.5 OD _600。
3. 颗粒的细菌在10,600 xĞ离心10分钟。取下并丢弃上清液。颗粒可以保存在-20°C，如果内毒素不会立即提取。

2。内毒素的提取

1. 首先，准备2X SDS缓冲区。在0.1的4％β-巯基乙醇（BME）的4％SDS 50 mL溶液和20％甘油中号的Tris-HCl，pH值6.8。添加少许溴酚蓝染的解决方案。稀释2张s，使一个1X SDS-缓冲库存滴答1:1无菌H _{2 O}这可以在室温下保存。
2. 在无菌H _{2 O}三个独立的10毫克/毫升，抗酶，核糖核酸酶，蛋白酶K的解决方案
3. 悬浮颗粒的细菌，在1X SDS缓冲区的200微升1.3步。确保完全被吸取的解决方案，慢慢地向上和向下的悬浮颗粒。不要旋涡。
4. 悬浮的细菌在15分钟的水浴煮沸。让溶液在室温下冷却15分钟。
5. 添加5μLDNase I可在2.2准备RNase的解决方案。在37°C孵育30分钟的样品。 *这一步是可选的;中的内毒素核酸治疗和非治疗的样品之间的质量差异最小。
6. 加入10μL蛋白酶K在2.2编写的解决方案。样品在59℃孵育3小时。这一步可以在一夜之间完成，如果有时间限制。
7. 每个样品，广告D 200μL冰冷的Tris-饱和酚（水饱和酚可作为替代的Tris-饱和酚是不可用）。确保上管关紧瓶盖，涡每个样品约5至10秒。
8. 样品在65℃孵育15分钟，偶尔涡旋。孵化后冷却至室温，然后加入1毫升每个样品室温乙醚和5至10秒涡。务必在通风柜执行手柄乙醚，因为它是不稳定的。
9. 在20,600 xĞ离心10分钟的样品。小心取出离心样品和提取底部的蓝色层。一定要避免上，层次清晰。只留下少量的蓝色层，最好与上层污染。
10. 重新抽取样品重复步骤2.7 - 2.9。两个拔牙通常就足够了。如果样本出现阴天，更拔牙可能是performe的D。加入200μL的2X SDS缓冲区的每个提取的样品经SDS-PAGE分离之前。样品可以运行在8％-15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。 5至15μL准备使用这种方法脂多糖通常是足够的可视化。

3。代表结果

上述准备的内毒素的样品可以直接染色可视化的SDS-PAGE分离后，用一个标准的银染的协议或市售的毒素染色试剂盒。另外，在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的毒素可能被转移到硝酸纤维素膜，并受到西方免疫使用脂多糖特异性抗血清。对于这个协议，我们使用的Pro - Q翡翠300脂多糖凝胶染色试剂盒（分子探针），并遵循制造商的指示。

在图1所示是亲 - Q翡翠300染色12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。每个通道包含15μL准备从不同的脂多糖鼻疽dolosa ferent菌株分离囊性纤维化患者的痰标本。不同的毒素带梯子图案，反光O-抗原重复连接到核心寡糖的单位不同的号码，是显而易见的，使用这种方法，例如，在1和6车道的样本也有类似的带型向对方（红色盒装）。

图1。临- Q翡翠300名来自的鼻疽dolosa临床株染毒素。脂多糖从7 B。如在本协议中所述在囊性纤维化患者的爆发dolosa株。十五微升12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并与临 - Q翡翠300染色分离，每制造商的指示。脂多糖核心显示一个箭头，红色盒装脂多糖显示类似带O-抗原重复模式。 M =分子量。

Discussion

我们所描述的脂多糖远离其他细胞成分，包括核酸和蛋白质纯化的方法。这种方法提供了高品质的脂多糖，可以在许多不同的可视化方法，如在图1所示，包括碳水化合物SDS-PAGE凝胶染色用。这种方法可用于从各种不同的菌株血清型的毒素，用特异性抗血清，或显示直视的菌株之间的相关性。例如，最近的全基因组测序与LPS表征结合项目B 的爆发dolosa领导发现，与这些菌株在¹¹内毒素的存在和缺乏相关的单核苷酸多态性（SNP）。我们相信，这种方法是可取的希区柯克和布朗⁹所描述的全细胞裂解蛋白酶处理，因为它是一个比较快，但不够严谨，以产生高品质的进一步分析脂多糖第

虽然我们只使用鼻疽dolosa一个例子，这个协议可以适应其他革兰氏阴性物种的，以及。我们已经成功地使用这种协议从其他伯克霍尔德菌脂多糖提取和可视化。，大肠杆菌 ， 幽门螺旋杆菌，绿脓杆菌和沙门氏菌 。如果协议中很少或根本没有毒素产量的结果，它可能是LPS的分馏，以不同的层中提取步骤，2.7-2.9。若要解决这个问题，重复的协议，并保存在每一层的样本提取步骤，这些都可以可视化染色的SDS-PAGE电泳，以确定毒素的地方分馏，该协议可以作相应的修改。还应当指出，这个协议，而理想的分析目的，不产生毒素，是适合于其他应用，如结构分析，。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase I recombinant, RNase-free	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
Proteinase K	Fisher Scientific	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes, Life Technologies	P20495