Summary
Wir beschreiben ein modifiziertes heißen wässrigen-Phenolextraktion Verfahren zum Reinigen von Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen Bakterien. Sobald extrahiert wurden, kann die LPS anschließend durch SDS-PAGE analysiert und visualisiert werden durch direkte Färbung oder Western-Immunoblot-.
Abstract
Lipopolysaccharid (LPS) ist ein wichtiger Bestandteil von Gram-negativen bakteriellen äußeren Membranen. Es ist eine dreigliedrige Molekül, das aus Lipid A, das in der äußeren Membran eingebettet ist, ein Kern-Oligosaccharid und Wiederholen der O-Antigen-Einheiten, die nach außen erstrecken sich von der Oberfläche der Zelle 1, 2. LPS ist ein Molekül, das immundominante wichtig für die Virulenz und Pathogenese vieler Bakterienarten, darunter Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-Arten, und Escherichia coli 3-5, und Unterschiede in der LPS O-Antigen-Zusammensetzung bilden die Grundlage für die Serotypisierung der Stämme. LPS wird in Anlage beteiligten Zellen zu Beginn der Infektion Host und bietet Schutz vor Komplement-vermittelte Tötung; Stämme, die LPS fehlt, gedämpft werden kann für die Virulenz 6-8. Aus diesen Gründen ist es wichtig, LPS visualisieren, insbesondere aus klinischen Isolaten. Visualisierung von LPS Bandenmuster und Erkennung durch spezifische einntibodies können nützliche Werkzeuge sein, um Stamm-Linien zu identifizieren und verschiedenen Mutanten zu charakterisieren.
In diesem Bericht beschreiben wir eine heiße wässrige Phenol-Verfahren zur Isolierung und Reinigung von LPS aus Gram-negativen bakteriellen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Extraktion von LPS von Nukleinsäuren und Proteinen, die mit Visualisierung von LPS, die mit kürzeren, weniger intensiv Extraktionsverfahren 9 erfolgt stören können. LPS diese Weise hergestellten durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und gefärbt direkt unter Verwendung von Kohlenhydrat / Glykoprotein Flecken oder Standard-Silberfärbung Verfahren getrennt werden können. Viele Anti-Seren gegen LPS Antikörper enthalten, dass mit der äußeren Membran-Proteine oder andere antigene Ziele, kann ein Hindernis für kreuzreagieren Reaktivität nach Western-Immunoblot-SDS-PAGE getrennt Zelllysat beobachtet. Protease-Behandlung von Zelllysat allein ist nicht immer ein wirksames Mittel zur Beseitigung dieserHintergrund der Nutzung dieser oder andere Visualisierungs-Methoden. Ferner kann umfangreiche Proteasebehandlung in einem Versuch, dieses Objekt zu entfernen, schlechter Qualität LPS, die nicht gut von einem der vorgenannten Verfahren gelöst führen. Aus diesen Gründen glauben wir, dass das folgende Protokoll, aus Westpahl Jann und 10 angepasst, ideal für die LPS-Extraktion ist.
Protocol
1. Vorbereitung der Bakterien für die LPS-Extraktion
- Starten Sie eine Übernachtkultur in 5 ml Luria Broth (LB), die mit Antibiotika bei Bedarf ergänzt. Kultur wachsen über Nacht (12-18 Stunden) in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute.
- Verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis 1:10 mit LB und nehmen eine OD 600 Lektüre in einem Spektralphotometer. Basierend auf der OD 600 Lektüre, machen Sie eine 1,5 ml Suspension aus Ihrem Bakterien auf eine OD 600 von 0,5.
- Pellet die Bakterien in einer Mikrozentrifuge bei 10.600 x g für 10 Minuten. Entfernen und den Überstand verwerfen. Das Pellet kann bei -20 ° C gelagert werden, wenn LPS nicht geht ist, sofort extrahiert werden.
2. Extraktion von LPS
- Zuerst bereiten 2x SDS-Puffer. Einen 50 ml Lösung von 4% β-Mercaptoethanol (BME), 4% SDS und 20% Glycerin in 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Fügen Sie eine Prise Bromphenolblau, um die Lösung zu färben. Machen Sie einen 1x SDS-Puffer Lager durch Verdünnung von 2x Stock 1:1 in sterilem destilliertem H 2 O. Dies kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Machen Sie drei separate 10 mg / ml Lösung von DNase I, RNase-und Proteinase K in sterilem destilliertem H 2 O.
- Resuspendieren pelletierten Bakterien aus Schritt 1.3 in 200 ul 1x SDS-Puffer. Sie sicher, dass das Pellet vollständig durch Pipettieren der Lösung langsam auf und ab resuspendiert. Nicht vortexen.
- Kochen suspendierter Bakterien in einem Wasserbad für 15 Minuten. Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten abkühlen.
- 5 l der beiden DNase I und RNase-Lösungen in 2.2 vorbereitet. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 30 Minuten. * Dieser Schritt ist optional, es gibt minimale Unterschied in der Qualität von LPS zwischen Nuklease-behandelten und unbehandelten Proben.
- In 10 ul der Proteinase K-Lösung in 2.2 vorbereitet. Inkubieren der Proben bei 59 ° C für 3 Stunden. Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, wenn es Zeitdruck sind.
- Zu jeder Probe add 200 pl eiskaltem Tris-gesättigtem Phenol (Wasser gesättigtem Phenol kann als Ersatz verwendet werden, wenn Tris-gesättigtem Phenol steht nicht zur Verfügung). Stellen Sie sicher, die Kappen an die Rohre dicht verschlossen sind, und Vortex jede Probe für etwa 5 bis 10 Sekunden.
- Inkubieren der Proben bei 65 ° C für 15 Minuten, gelegentlich Vortexen. Nach Inkubation bei Raumtemperatur abkühlen lassen, dann fügen Sie 1 mL bei Raumtemperatur Diethylether zu jeder Probe und Vortex für 5 bis 10 Sekunden. Achten Sie darauf, Griff Äther in einem Abzug durchführen, da es flüchtig ist.
- Zentrifugation der Proben bei 20.600 × g für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig die Proben aus der Zentrifuge und extrahieren Sie die untere blaue Schicht. Achten Sie darauf, die obere, klare Schicht zu vermeiden. Zurücklassung einer kleinen Menge des blauen Schicht ist bevorzugt, um eine Kontamination mit der oberen Schicht.
- Extrahieren Sie erneut die Proben durch Wiederholen der Schritte von 2,7 bis 2,9. Zwei Extraktionen sind in der Regel ausreichend. Wenn die Proben bedeckt erscheinen, kann mehr sein Extraktionen performed. Zugabe von 200 ul 2x SDS-Puffer zu jedem der extrahierten Proben vor der Trennung durch SDS-PAGE. Die Proben können bei 8% -15% SDS-Polyacrylamid-Gelen laufen gelassen werden. Fünf bis fünfzehn ul von LPS unter Verwendung dieser Methode ist in der Regel ausreichend für die Visualisierung.
3. Repräsentative Ergebnisse
LPS Proben wie oben hergestellt visualisiert werden kann durch direkte Färbung nach der Trennung auf SDS-PAGE unter Verwendung eines Standard-Silber-Färbung Protokoll oder ein im Handel erhältliches LPS-Färbekit. Alternativ kann LPS auf einem Polyacrylamidgel getrennt auf eine Nitrocellulosemembran übertragen werden und Western-Immunoblotting unter Verwendung LPS-spezifischen Anti-Seren. Aus diesem Protokoll verwendeten wir die Pro-Q Smaragd 300 Lipopolysaccharid Gel Stain Kit (Molecular Probes), und folgte den Anweisungen des Herstellers.
Dargestellt in Abbildung 1 ist ein Pro-Q 300 Smaragd gefärbten 12% SDS-Polyacrylamidgel. Jede Spur enthält 15 ul LPS aus unterschiedlichen vorbereitetschiedenen Stämme von Burkholderia dolosa isoliert aus Sputum-Proben von Patienten mit zystischer Fibrose. Verschiedene Streifen LPS Leitermuster, reflektierende unterschiedlicher Zahlen O-Antigen sich wiederholenden Einheiten, die an Kernoligosaccharid ergeben sich unter Verwendung dieses Verfahrens, zum Beispiel, müssen die Proben in Spur 1 und 6 ähnliche Bandenmuster miteinander (Kasten in rot).
Abbildung 1. Pro-Q Smaragd 300 gebeizt LPS von Burkholderia dolosa klinischen Isolaten. LPS aus sieben B. dolosa Stämme aus einem Ausbruch bei Mukoviszidose-Patienten isoliert wurden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Fünfzehn ul wurden auf einem 12% SDS-Polyacrylamid-Gel, und gefärbt mit Pro-Q Smaragd 300 getrennt, pro Anweisungen des Herstellers. LPS-Kern einen Pfeil gekennzeichnet, und LPS zu ähnlichen Bandenmuster von O-Antigen Wiederholungen sind in rot eingerahmt. M = Molekulargewichtsmarker.
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Discussion
Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von LPS von anderen zellulären Komponenten, einschließlich Nukleinsäuren und Proteinen beschrieben. Diese Methode bietet eine hohe Qualität LPS, die in einer Reihe von verschiedenen Visualisierungsmethoden, einschließlich des Kohlenhydrat-Färbung der SDS-PAGE-Gelen, wie in 1 gezeigt ist, verwendet werden kann. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um LPS aus einer Vielzahl von Stämmen Serotyp, unter Verwendung spezifischer Antiseren, oder um eine Verwandtschaft zwischen den Isolaten durch direkte Visualisierung zeigen. Zum Beispiel kann ein letzten genomweiten Sequenzierprojekt in Kombination mit LPS Charakterisierung von einem Ausbruch von B. dolosa führte zur Entdeckung eines Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP), die mit der Gegenwart und Abwesenheit von LPS in diesen Stämmen 11 korreliert. Wir glauben, dass diese Methode vorzuziehen, die Protease-Behandlung von Ganzzelllysate von Hitchcock und Brown 9 beschrieben ist, da es eine relativ schnelle und doch streng genug, um hochwertige LPS für die weitere Analyse ergeben ists.
Obwohl wir nur ein Beispiel unter Verwendung des Burkholderia dolosa, kann dieses Protokoll auf andere gram-negative Spezies angepasst als gut. Wir haben erfolgreich dieses Protokolls verwendet zu extrahieren und zu visualisieren LPS aus anderen Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa und Salmonella spp. Wenn das Protokoll eine geringe oder keine LPS Ausbeute, kann es sein, dass die LPS in eine andere Ebene in den Extraktionsstufen, 2,7-2,9 fraktioniert. Um dies zu beheben, wiederholen Sie das Protokoll und speichern Sie eine Probe von jeder Schicht während der Extraktion Schritte, können diese durch Färbung eines SDS-PAGE-Gel um, wo die LPS fraktioniert bestimmen visualisiert, und das Protokoll kann entsprechend modifiziert werden. Es ist auch anzumerken, dass dieses Protokoll, während sich ideal für analytische Zwecke ergibt keine LPS, die für andere Anwendungen, wie zum Beispiel Strukturanalysen ist.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health und der Mukoviszidose-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche Group | 04716728001 | |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | |
| Proteinase K | Fisher Scientific | BP1700 | |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher Scientific | BP1750-100 | |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 | |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes, Life Technologies | P20495 |
References
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