Summary
Nós descrevemos um método modificado de extracção a quente aquoso-fenol para a purificação de lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas. Uma vez extraído, os LPS pode ser subsequentemente analisadas por SDS-PAGE e visualizados por coloração directa ou imunotransferência Western.
Abstract
Lipopolissacarídeo (LPS) é um componente importante da bacteriana gram-negativa membranas externas. É uma molécula tripartido consistindo de lípido A, que é incorporado na membrana externa, um núcleo de oligossacáridos e repetindo O-antigénio unidades que se estendem para fora a partir da superfície da célula 1, 2. LPS é uma molécula imunodominante que é importante para a virulência e patogénese de muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, espécies de Salmonella e Escherichia coli 3-5, e as diferenças na forma de composição LPS O-antigénio a base para serotipagem de estirpes. LPS está envolvido na ligação a células hospedeiras no momento do início da infecção e fornece protecção contra a morte mediada pelo complemento; estirpes que carecem de LPS pode ser atenuado para a virulência 6-8. Por estas razões, é importante para a visualização de LPS, particularmente a partir de isolados clínicos. LPS Visualizing bandas padrões e reconhecimento por um específicontibodies podem ser ferramentas úteis para identificar linhagens de deformação e caracterizar vários mutantes.
Neste relatório, nós descrevemos um método aquosa-fenol quente para o isolamento e purificação de LPS de bactérias Gram-negativas células bacterianas. Este protocolo permite a extracção de LPS de distância a partir de ácidos nucleicos e proteínas que podem interferir com a visualização do LPS, que ocorre com mais curtos, métodos de extracção menos intensivos 9. LPS preparados desta maneira podem ser separados por dodecilsulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida electroforese em gel (PAGE) e directamente corado usando hidrato de carbono / glicoproteína manchas ou métodos de coloração padrão de prata. Muitos anti-soros para LPS conter anticorpos que reagem de forma cruzada com as proteínas da membrana externa ou alvos antigénicos outros que podem dificultar a reactividade observados após immunoblot ocidental de SDS-PAGE separados lisados celulares brutos. Tratamento com protease de lisados celulares brutos por si só não é sempre uma forma eficaz de remoção destafundo de usar este ou outros métodos de visualização. Além disso, o tratamento da protease extensa, numa tentativa de remover este pano de fundo pode levar a LPS de baixa qualidade que não é bem resolvidos por qualquer um dos métodos acima mencionados. Por estas razões, acreditamos que o protocolo seguinte, adaptado de Westpahl e Jann 10, é ideal para a extracção de LPS.
Protocol
1. Preparação de bactérias para Extração de LPS
- Iniciar uma cultura durante a noite em 5 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com antibióticos, se necessário. Crescer a cultura durante a noite (12-18 horas) em uma agitação incubadora a 37 ° C e 200 rpm.
- Diluir a 1:10 com cultura LB e tomar uma OD 600 leitura em espectrofotômetro. Com base na OD 600 leitura, fazer uma suspensão de 1,5 mL dos seus bactérias para uma DO600 de 0,5.
- Sedimentar as bactérias numa microcentrífuga a 10.600 x g durante 10 minutos. Remova e descarte o sobrenadante. O sedimento pode ser armazenada a -20 ° C, se LPS não vai ser extraído imediatamente.
2. Extracção de LPS
- Primeiro, prepara 2x tampão de SDS. Fazer uma solução de 50 mL de 4% β-mercaptoetanol (BME), SDS 4% e glicerol a 20% em 0,1 M de Tris-HCl, pH 6,8. Adicionar uma pitada de azul de bromofenol para tingir a solução. Faça um estoque 1x SDS-tampão diluindo 2X stac 1:1 em destilada estéril H 2 O. Isto pode ser armazenado à temperatura ambiente.
- Faça três separadas 10 mg / mL de soluções de DNase I, RNase, e proteinase K em destilada estéril H 2 O.
- Ressuspender as bactérias peletizadas a partir do passo de 1,3 em 200 ul de SDS-1x buffer. Assegurar que o pelete é ressuspenso completamente por pipetagem a solução cima e para baixo lentamente. Não vórtice.
- Ferver as bactérias em suspensão em um banho de água durante 15 minutos. Permitir que a solução a arrefecer à temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Adicionar 5 uL de ambos DNase I e soluções RNase preparado em 2,2. Incubar as amostras a 37 ° C durante 30 minutos. * Este passo é opcional, não há diferença mínima na qualidade de LPS entre as amostras de nuclease-tratados e não tratados.
- Adicionar 10 ul da solução de proteinase K preparado em 2,2. Incubar as amostras a 59 ° C durante 3 horas. Esta etapa pode ser realizada durante a noite, se existem restrições de tempo.
- Para cada amostra de anúncio,d uL 200 de gelo-frio de Tris-fenol saturado (saturado de água fenol pode ser utilizado como um substituto se Tris-fenol saturado não está disponível). Garantir as tampas nos tubos são fechados hermeticamente, e cada amostra de vórtice durante cerca de 5 a 10 segundos.
- Incubar as amostras a 65 ° C durante 15 minutos, vortex ocasionalmente. Após incubação arrefecer à temperatura ambiente, em seguida, adicionar 1 mL de temperatura ambiente éter dietílico para cada amostra e vortex durante 5 a 10 segundos. Certifique-se de realizar éter pega em um exaustor, como ele é volátil.
- Centrifugar as amostras a 20.600 X g durante 10 minutos. Remover cuidadosamente as amostras da centrífuga e extrair a camada de fundo azul. Certifique-se de evitar a camada superior, claro. Deixando para trás uma pequena quantidade da camada de azul é preferível a contaminação com a camada superior.
- Re-extrair as amostras, repetindo os passos 2,7-2,9. Duas extracções são normalmente suficientes. Se as amostras de aspecto turvo, extrações mais pode ser performed. Adicionar 200 ul de 2x tampão SDS-a cada uma das amostras extraídas antes de separar por SDS-PAGE. As amostras podem ser executados em 8% -15% de poliacrilamida SDS-géis. Cinco a 15 ul de LPS preparados usando este método é geralmente suficiente para visualização.
3. Os resultados representativos
As amostras de LPS preparadas como acima pode ser visualizada por coloração directa após a separação por SDS-PAGE utilizando coloração de prata de um protocolo padrão ou um kit de coloração comercialmente disponível LPS. Alternativamente, o LPS separados num gel de poliacrilamida pode ser transferida para uma membrana de nitrocelulose e sujeitas a Western immunoblotting utilizando LPS-específico anti-soros. Para este protocolo, foi utilizado o Pro-Q Emerald 300 Kit Gel Stain lipopolissacarídeo (Molecular Probes), e seguiu as instruções do fabricante.
Mostrada na Figura 1 é um Pro-Q Emerald 300 manchado 12% de gel de SDS-poliacrilamida. Cada pista contém 15 uL de LPS preparados a partir de dicepas diferentes de Burkholderia dolosa isolado de amostras de escarro de pacientes com fibrose cística. LPS diferentes padrões de bandas de escada, reflectoras de números diferentes de antigénios S-unidades de repetição ligados ao núcleo oligossacárido, são evidentes utilizando este método, por exemplo, as amostras em pista 1 e 6 têm padrões de bandas semelhantes um ao outro (disponível comercialmente em vermelho).
Figura 1. Pro-Q Esmeralda 300 LPS manchadas de isolados de Burkholderia dolosa clínicos. LPS de B. sete cepas dolosa de um surto em pacientes com fibrose cística foram isoladas como descrito neste protocolo. Quinze uL foram separados num gel de 12% SDS-poliacrilamida, e coradas com Pro-Q Emerald 300, segundo as instruções do fabricante. LPS núcleo é indicado uma flecha, e LPS que mostram padrões similares de bandas de O-antígeno repete são embalados em vermelho. M = marcador de peso molecular.
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Discussion
Nós descrevemos um método de purificação de LPS de distância a partir de outros componentes celulares, incluindo ácidos nucleicos e proteínas. Este método proporciona alta qualidade LPS que podem ser utilizados num certo número de métodos de visualização diferentes, incluindo coloração de hidratos de carbono géis de SDS-PAGE, como mostrado na Figura 1. Este método pode ser usado para serotipar LPS a partir de uma variedade de estirpes, utilizando anticorpos específicos anti-soros, ou para mostrar parentesco entre isolados por visualização directa. Por exemplo, um recente projeto de seqüenciamento do genoma em combinação com LPS caracterização de um surto de B. dolosa levou à descoberta de um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) que se correlaciona com a presença e na ausência de LPS nestas 11 estirpes. Acreditamos que este método é preferível ao tratamento com protease de célula inteira lisados descritos por Hitchcock e Brown 9, como é um relativamente rápida, ainda suficientemente rigorosas para se obter alta qualidade LPS para analisar ainda maiss.
Enquanto que apenas mostram um exemplo usando o dolosa Burkholderia, este protocolo pode ser adaptado a outras espécies Gram-negativas, bem. Temos utilizado com sucesso este protocolo para extrair e visualizar LPS de outros Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella spp. Se os resultados do protocolo em pouca ou nenhuma produção de LPS, pode ser que o LPS fraciona para uma camada diferente nas etapas de extracção, 2,7-2,9. Para solucionar isso, repita o protocolo e guardar uma amostra de cada camada durante as etapas de extração, estes podem ser visualizados através da coloração de um gel de SDS-PAGE, a fim de determinar onde o fraciona LPS, e do protocolo pode ser alterado em conformidade. Deve também ser notado que este protocolo, enquanto ideal para fins analíticos, não produz LPS que é apropriado para outras aplicações, tais como as análises estruturais.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde ea Fundação de Fibrose Cística.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche Group | 04716728001 | |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | |
| Proteinase K | Fisher Scientific | BP1700 | |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher Scientific | BP1750-100 | |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 | |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes, Life Technologies | P20495 |
References
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , Forthcoming (2011).
