Summary
Мы описываем изменение горячей водно-фенольной экстракции способ очистки липополисахарида (ЛПС) из грам-отрицательных бактерий. После извлечения, ЛПС может быть в дальнейшем проанализированы SDS-PAGE и визуализировать прямого окрашивания или Западной иммуноблота.
Abstract
Липополисахарида (ЛПС) является основным компонентом грамотрицательных бактериальных внешней оболочки. Это трехстороннее молекула, состоящая из липидного, который встроен в наружную оболочку, олигосахарид кора и повторяющиеся О-антиген единиц, которые выходят наружу от поверхности клетки 1, 2. LPS является иммунодоминантных молекула, которая имеет важное значение для вирулентности и патогенезе многих видов бактерий, в том числе синегнойной палочки, сальмонелл видов, и кишечная палочка 3-5, и различия в LPS О-антиген состава составляют основу для серотипирования штаммов. LPS участвует в приложении к клеткам хозяина в начале инфекции и обеспечивает защиту от комплемент-опосредованной убийство; штаммы, которые не имеют ЛПС может быть ослаблен на вирулентность 6-8. По этим причинам, важно, чтобы визуализировать ЛПС, в частности, от клинических изолятов. Визуализация LPS бэндинга и признание конкретныхntibodies могут быть полезными инструментами для выявления штамма линий и охарактеризовать различные мутанты.
В этом докладе мы описываем горячего водного фенола метод выделения и очистки от ЛПС грам-отрицательных бактерий. Этот протокол позволяет по добыче ЛПС от нуклеиновых кислот и белков, которые могут препятствовать визуализации LPS, что происходит с более короткими, менее интенсивными методами добычи 9. LPS подготовлена таким образом, могут быть разделены додецилсульфата натрия (SDS), электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и непосредственно окрашенных использование углеводов / гликопротеин пятна или стандартных методов окрашивания серебром. Многие анти-сывороток LPS содержат антитела, которые перекрестно реагируют с внешней мембранных белков или других целей антигенного, которые могут помешать реактивности наблюдаются следующие Западной иммуноблота в SDS-PAGE разделенных сырой лизатов клеток. Протеазы лечение сырой лизатов клетки сами по себе не всегда является эффективным способом устранения этогофоновом режиме, используя эту или другие методы визуализации. Кроме того, интенсивное лечение протеазы в попытках удалить этот фон может привести к ухудшению качества LPS, что не очень хорошо решить ни одной из вышеупомянутых методов. По этим причинам мы считаем, что следующий протокол, адаптированный Westpahl и Янн 10, идеально подходит для извлечения ЛПС.
Protocol
1. Подготовка бактерий для добычи LPS
- Начать ночной культуры в 5 мл бульона Лурия (LB), дополненная антибиотиками, если необходимо. Рост культуры ночь (12-18 часов) в дрожащей инкубаторе при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту.
- Развести культуры 1:10 LB и принимают OD 600 чтение в спектрофотометр. На основе OD 600 чтение, сделать 1,5 мл суспензии бактерий ваш OD 600 0.5.
- Гранул бактерий в микроцентрифуге на 10600 х г в течение 10 минут. Удаляют супернатант. Гранулы могут храниться при температуре -20 ° С, если ЛПС не собирается быть извлечены сразу.
2. Добыча LPS
- Во-первых, подготовить 2x SDS буфера. Сделайте 50 мл раствора 4% β-меркаптоэтанол (BME), 4% SDS и 20% глицерина в 0,1 М Трис-HCl, рН 6,8. Добавить щепотку бромфенола синей окраски раствора. Сделать 1x SDS-буферный запас путем разбавления 2X сТок 1:1 в стерильной дистиллированной H 2 O. Это можно хранить при комнатной температуре.
- Сделайте три отдельных 10 мг / мл решения ДНКазы I, РНКазы, и протеиназы К в стерильной дистиллированной H 2 O.
- Ресуспендируют гранулированный бактерии, начиная с шага 1.3 в 200 мкл 1x SDS-буфера. Убедитесь, что осадок полностью ресуспендировали с помощью пипетки раствор вверх и вниз медленно. Не вихрь.
- Варить приостановлено бактерий на водяной бане в течение 15 минут. Позвольте решение для охлаждения при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Добавьте 5 мкл и ДНКазы I и РНКазы растворов, приготовленных в 2.2. Инкубируйте образцов при температуре 37 ° С в течение 30 минут. * Этот шаг является необязательным, есть минимальная разница в качестве между LPS нуклеазы обработанных и необработанных образцов.
- Добавить 10 мкл раствора протеиназы К подготовлен в 2.2. Инкубируйте образцов при 59 ° С в течение 3 часов. Этот шаг может быть выполнен за одну ночь, если существуют ограничения по времени.
- Для каждого образца, объявлениег 200 мкл ледяной Трис-насыщенных фенол (насыщенный водой фенола может быть использован в качестве замены, если Трис-насыщенных фенол не доступен). Убедитесь, что ограничения на трубы плотно закрыты, и вихрь каждого образца в течение приблизительно 5 до 10 секунд.
- Инкубируйте образцов при температуре 65 ° С в течение 15 минут, встряхивая время от времени. После инкубации остыть до комнатной температуры, затем добавьте 1 мл при комнатной температуре диэтиловый эфир каждого образца и вихрь от 5 до 10 секунд. Будьте уверены, чтобы выполнять ручкой эфир в вытяжном шкафу, так как он является летучим.
- Центрифуга образцов при 20600 х г в течение 10 минут. Осторожно выньте образцы из центрифуги и извлечь нижней голубой слой. Будьте уверены, чтобы избежать верхний прозрачный слой. Оставив позади небольшое количество голубой слой предпочтительнее загрязнения верхнего слоя.
- Повторное извлечение образцов, повторяя шаги 2.7 - 2.9. Два экстракции, как правило, достаточно. Если образцы появляются облачно, более экстракции может быть performeг. Добавить 200 мкл 2x SDS-буфера для каждого из извлеченных образцов до разделения на SDS-PAGE. Образцы могут быть запущены на 8% -15% SDS-полиакриламидном геле. От пяти до пятнадцати мкл LPS подготовлен с использованием этого метода, как правило, достаточным для визуализации.
3. Представитель Результаты
LPS образцах, изготовленных, как указано выше могут быть визуализированы прямого окрашивания после разделения на SDS-PAGE с использованием стандартной серебристо-окрашивание протокола или продаже LPS окрашивания комплект. Кроме того, ЛПС разделены на полиакриламидном геле могут быть переданы нитроцеллюлозные мембраны и подвергают западные иммуноблоттинга использовании ЛПС конкретные анти-сыворотки. Для этого протокола, мы использовали Pro-Q Emerald 300 липополисахарида гель пятна Kit (Molecular Probes) и следуют инструкциям изготовителя.
Показанный на рисунке 1, Pro-Q Emerald 300 окрашенный 12% SDS-полиакриламидном геле. Каждая полоса содержит 15 мкл LPS готовят из дифразличным штаммов Burkholderia dolosa изолированы от образцов мокроты больных муковисцидозом. Различные LPS полосы лестница моделей, отражающих различные числа О-антиген повторяющиеся единицы прикреплены к основной олигосахаридов, очевидны, используя этот метод, например, образцов в полосе 1 и 6 имеют схожие бэндинга друг к другу (коробке красного цвета).
Рисунок 1. Pro-Q Emerald 300 окрашенных LPS от Burkholderia dolosa клинических изолятов. LPS из семи B. dolosa штаммов от вспышки у больных муковисцидозом выделяли, как описано в этом протоколе. Пятнадцать мкл были разделены на 12% SDS-полиакриламидном геле и окрашивали Pro-Q Emerald 300, в соответствии с инструкциями производителя. LPS Core указана стрелкой, а LPS схожих бэндинга О-антиген повторяется зажаты в красный цвет. M = маркер молекулярного веса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали способ очистки LPS от других клеточных компонентов, включая нуклеиновые кислоты и белки. Этот метод обеспечивает высокое качество ЛПС, которые могут использоваться в целом ряде различных методов визуализации, в том числе углеводный окрашивания SDS-PAGE гелей, как показано на рисунке 1. Этот метод может быть использован для серотипа LPS из различных штаммов, с использованием специфических анти-сыворотки, или показать родство между изолятов прямой визуализации. Например, недавно генома последовательности проектов в сочетании с характеристикой LPS от вспышки B. dolosa привело к открытию одного нуклеотидного полиморфизма (SNP), что коррелирует с наличием и отсутствием LPS в этих штаммов 11. Мы считаем, что этот метод является более предпочтительным, чем протеазы лечения целого клеточных лизатов описывается Хичкока и Браун 9, так как это относительно быстро, но достаточно строгими для получения высококачественных LPS для дальнейшего анализас.
Пока мы только показать пример использования Burkholderia dolosa, этот протокол может быть адаптирован для других грамотрицательных видов. Мы успешно использовали этот протокол для извлечения и визуализации LPS от других Burkholderia SPP., Кишечной палочки, хеликобактер, синегнойная палочка и сальмонелла. Если протокол результатов мало или вообще не выход ЛПС, может быть, что LPS fractionates в другой слой в добыче шаги 2.7-2.9. Чтобы устранить это, повторяю протокола и сохранить образцы каждого слоя при добыче шагов, они могут быть визуализированы окрашивания SDS-геле для того, чтобы определить, где LPS fractionates, и протокол может быть изменен соответственно. Следует также отметить, что этот протокол, в то время идеально подходит для аналитических целей, не дает ЛПС, который подходит для других приложений, таких как структурный анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и кистозный фиброз фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche Group | 04716728001 | |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | |
| Proteinase K | Fisher Scientific | BP1700 | |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher Scientific | BP1750-100 | |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 | |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes, Life Technologies | P20495 |
References
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , Forthcoming (2011).
