Summary
Biz Gram-negatif bakterilerden lipopolisakkarid (LPS) arıtılması için modifiye edilmiş bir sıcak sulu-fenol ekstraksiyon yöntemi açıklar. Bir kez çıkarılan, LPS sonradan SDS-PAGE ile analiz ve direkt boyama ya da Batı immunoblotting tarafından görüntülenebilir.
Abstract
Lipopolisakkarid (LPS) Gram-negatif bakterilerin dış zarının önemli bir bileşenidir. Bu lipid oluşan üçlü bir moleküldür dış membran içine gömülü olan A, hücre 1, 2 yüzeyinden dışa doğru uzanan temel bir oligosakarit ve tekrar eden O-antijen birimi. LPS Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, ve Escherichia coli 3-5, ve LPS O-antijen kompozisyonu formunda suşunun serotipleme için temel farklılıkları dahil, birçok bakteri türleri, ölümcüllüğünü ve patogenezine için önemli olan bir bağışıklık ağırlıklı bir moleküldür. LPS enfeksiyon başlangıcında hücreler ev sahipliği ekinde yer alan ve kompleman aracılı öldürülmesine karşı koruma sağlayan; LPS yoksun suşları virulans 6-8 için zayıflatılmış olabilir. Bu sebeplerden dolayı, özellikle klinik olarak izole edilen, LPS canlandırmak için önemlidir. Belirli bir tarafından desenleri ve tanıma bantlama görselleştirme LPSntibodies gerginlik soy tespit etmek ve çeşitli mutantlar karakterize etmek için faydalı bir araç olabilir.
Bu yazıda, Gram-negatif bakteri hücrelerinin LPS izolasyonu ve saflaştırılması için sıcak sulu-fenol yöntemi açıklar. Bu protokol uzaklıkta 9 daha kısa, daha az yoğun ekstraksiyon yöntemleri ile oluşur LPS görselleştirme engelleyebilir nükleik asitlerin ve proteinlerin gelen LPS çıkarılması için izin verir. LPS bu şekilde karbonhidrat / glikoprotein lekeler veya standart gümüş boyama yöntemleri kullanılarak sodyum dodesil sülfat (SDS)-poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ve doğrudan lekeli ayrılabilir hazırlanmıştır. LPS anti-sera Birçok sürebiliyor dış membran proteinleri veya diğer antijenik hedefleri ile çapraz reaksiyona reaktivite SDS-PAGE ile ayrılmış ham hücre lizatları Batı immunoblotting sonrası gözlenen bu antikorları içerir. Tek başına ham hücre lizatlarının Proteaz tedavi her zaman bu silmenin en etkili yolu değilBu veya diğer görüntüleme yöntemleri kullanılarak arka plan. Dahası, bu arka kaldırmak için bir girişim geniş proteaz tedavisinde de yukarıda belirtilen yöntemlerden herhangi çözülemezse düşük kaliteli LPS yol açabilir. Bu nedenlerle, biz Westpahl ve Jann 10 uyarlanan aşağıdaki protokol, LPS ekstraksiyon için ideal olduğuna inanıyorum.
Protocol
1. LPS Ekstraksiyon için Bakteri hazırlanması
- Gerekirse antibiyotikler ile desteklenmiş Luria Broth (LB), 5 mL, bir gece kültüre başlar. Bir 37 kuvöz sallayarak ° C ve 200 rpm (12-18 saat) gece kültürü büyütün.
- LB ile kültür 01:10 seyreltilir ve bir spektrofotometre bir OD 600 okuma alır. OD 600 okuma dayanarak, 0.5 OD 600 için bir bakteri 1.5 ml süspansiyon olun.
- Pelet 10 dakika boyunca 10.600 x g hızında bir mikrosantrifüj bakteri. Süpernatantı alın ve atın. LPS hemen ayıklanır olacak değilse pelet, -20 ° C'de saklanabilir.
2. LPS çıkarımı
- Birincisi, 2x SDS tamponu hazırlamak. 0,1 bir 50 mL% 4 β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS solüsyonu ve% 20 gliserol hale M Tris-HCl, pH 6.8. Çözüm boyamak için Bromophenol Mavi bir tutam ekleyin. 2X s seyreltilmesi ile 1x SDS-tampon stok olunsteril distile H 2 O da tak 01:01 Bu oda sıcaklığında saklanabilir.
- Steril damıtılmış H 2 O. in DNase I, RNaz ve Proteinaz K üç ayrı 10 mg / mL çözümler hale
- 1x SDS-tampon 200 ul adım 1.3 pelet bakteri süspanse edin. Pelet tamamen yavaş yavaş aşağı çözümü pipetleme tarafından süspanse emin olun. Vorteks yapmayın.
- 15 dakika su banyosunda asılı bakteri kaynatın. 15 dakika için oda sıcaklığında soğumasına izin çözeltisi.
- 2,2 hazırlanan DNase I ve RNaz çözümler hem 5 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe örnekleri. * Bu adım isteğe bağlıdır; nükleaz arıtılmış ve arıtılmamış örnekleri arasında LPS kalitesinde az fark vardır.
- 2,2 hazırlanan Proteinaz K solüsyonu 10 ul ekleyin. 3 saat boyunca 59 ° C'de inkübe örnekleri. Zaman kısıtlamaları vardır, bu adım, bir gece boyunca gerçekleştirilebilir.
- Her örnek, reklam içind 200 ul buz Tris-doymuş fenol (Tris-doymuş fenol yoksa suya doymuş fenol bir alternatif olarak kullanılabilir). Tüpler sıkıca kapalı üzerinde kapakları ve yaklaşık 5 ila 10 saniye vorteks her bir örnek olun.
- Ara sıra vorteks, 15 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe örnekleri. Oda sıcaklığına kadar soğutulur kuluçkaya sonra, daha sonra 1 Her numune için oda sıcaklığında ml dietil eter ve 5-10 saniye vorteks ekleyebilir. Volatil olduğu gibi, bir çeker ocak içinde kolu eter gerçekleştirmek için emin olun.
- 10 dakika için 20,600 x g'de santrifüje örnekleri. Dikkatlice santrifüj gelen örnekleri kaldırmak ve alt mavi katmanı ayıklayın. Üst, açık tabaka önlemek emin olun. Mavi tabakası küçük bir miktar geride kalacak üst tabaka ile kirlenme tercih edilir.
- 2.9 - 2.7 adımları tekrarlayarak örnekleri yeniden ayıklayın. İki ekstraksiyonu genellikle yeterlidir. Örnekleri bulanık görünür, daha fazla çekimi performe olabilird. SDS-PAGE ile ayırarak önce ekstre örneklerin her birine 2x SDS-tamponun 200 ul ekleyin. Örnekler 8% -15% SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırılabilir. Bu yöntemi kullanarak hazırlanan LPS beş ile on beş ul görünüm için genellikle yeterlidir.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Yukarıdaki gibi hazırlanan LPS örnekleri standart bir gümüş boyaması protokol veya piyasada bulunan LPS boyama kiti kullanılarak SDS-PAGE üzerinde ayrılığı takiben direkt boyama ile görülebilmesi. Alternatif olarak, bir poliakrilamid jel üzerinde ayrılır LPS bir nitroselüloz zarına aktarılır ve LPS spesifik anti-serumu kullanılarak immunoblotting Western tabi tutulabilir. Bu protokol için, Pro-Q zümrüt 300 Lipopolisakkaritlerinin Jel Stain Kit (Molecular Probes) kullanılır ve üreticinin talimatlarına izledi.
Bir Pro-Q Emerald 300 lekeli% 12 SDS-poliakrilamid jel Şekil 1'de gösterilmiştir. Her kulvar dif hazırlanan LPS 15 ul içerenBurkholderia dolosa özelliklerine ait farklı suşları kistik fibrozis hastaların balgam örneklerinden izole. Merdiven kalıplarını bantlama Farklı LPS, farklı sayıda oligosakkarit çekirdek bağlı birimleri tekrarlayarak O-antijeni yansıtıcı, bu yöntemi kullanarak belirgindir, örneğin şerit 1 ve 6 örnekleri birbirine benzer bant desenleri var (kırmızı kutulu).
Burkholderia dolosa klinik izole edilen Şekil 1. Pro-S Zümrüt 300 lekeli LPS. Yedi B. LPS Bu protokol açıklandığı gibi kistik fibroz hastalarında salgını gelen dolosa suşu izole edildi. Onbeş ul üreticinin talimatlarına göre, Pro-Q zümrüt 300 ile% 12 SDS-poliakrilamid jel ve vitray üzerine ayrıldı. LPS çekirdekli bir ok gösterilir, ve O-antijen tekrarlarının benzer bant desenleri gösteren LPS kırmızı kutu içinde edilir. M = Moleküler ağırlık işaretleyici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz, nükleik asitlerin ve proteinler de dahil olmak üzere diğer hücre bileşenleri, LPS ile saflaştırma uzak bir yöntemi de tarif etmiştik. Bu yöntem, Şekil 1'de gösterildiği gibi, SDS-PAGE jeli karbonhidrat boyama dahil olmak üzere çeşitli görsel yöntem, bir dizi kullanılabilir yüksek kalitede LPS sağlar. Bu yöntem, belirli bir anti-serumu kullanılarak, suşları çeşitli LPS serotip için, ya doğrudan görselleştirme tarafından izole arasındaki akrabalıkları göstermek üzere kullanılabilir. Örneğin, LPS karakterizasyonu ile birlikte yeni bir genom sıralama projesi B. salgını gelen dolosa bu suşların 11 LPS varlığı ve yokluğu ile ilişkilendiren tek nükleotid polimorfizmi (SNP) keşfine yol açtı. Çünkü daha analiz için yüksek kalitede LPS elde etmek için yeteri kadar sıkı bir henüz, nispeten hızlı bir şekilde, bu yöntem, Hitchcock ve Brown 9 tarafından tarif tam hücre lizatlarının proteaz tedavisi için tercih olduğuna inanıyoruzs.
Biz sadece Burkholderia dolosa kullanarak bir örnek gösterirken, bu protokolün yanı sıra diğer Gram-negatif türler adapte edilebilir. Biz başarıyla diğer Burkholderia spp LPS ayıklamak ve görselleştirmek için bu protokolü kullandık., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. Çok az veya hiç LPS verim protokolü sonuç varsa, LPS ekstraksiyon adımda başka bir katman, 2,7-2,9 üzere fractionates olabilir. Bu sorunu gidermek için, protokol tekrarlayın ve ekstraksiyon adımları sırasında her katman bir örnek kaydetmek, bu LPS fractionates belirlemek amacıyla bir SDS-PAGE jel boyama ile görülebilmesi ve protokolü buna göre değiştirilebilir. Bu amaçlar için analitik ideal bir süre Bu protokol, örneğin yapısal analizi gibi diğer uygulamalar için uygun olan LPS verim olmadığı ayrıca dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık ve Kistik Fibrozis Vakfı'nın National Institutes of hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche Group | 04716728001 | |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | |
| Proteinase K | Fisher Scientific | BP1700 | |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher Scientific | BP1750-100 | |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 | |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes, Life Technologies | P20495 |
References
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , Forthcoming (2011).
