Oprensning og visualisering af lipopolysaccharid fra Gram-negative bakterier ved varm vandig-phenolekstraktion

Summary

Vi beskriver en modificeret varm vandig ekstraktion med phenol fremgangsmåde til oprensning af lipopolysaccharid (LPS) fra gramnegative bakterier. Når først ekstraheres, kan de LPS efterfølgende analyseret ved SDS-PAGE og visualiseret ved direkte farvning eller Western immunoblot.

Abstract

Lipopolysaccharid (LPS) er en vigtig bestanddel af Gram-negative bakterielle ydre membraner. Det er et tredelt molekyle bestående af lipid A, der er indlejret i den ydre membran, en kerne oligosaccharid og gentagelse O-antigen-enheder, som strækker sig udad fra overfladen af cellen ^{1, 2.} LPS er en immundominant molekyle, som er vigtig for virulens og patogenesen af mange bakteriearter, herunder Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-arter, og Escherichia coli ^3-5, og forskelle i LPS O antigen-præparat danner grundlaget for serotypning af stammer. LPS er involveret i binding til værtsceller ved initiering af infektionen og giver beskyttelse af komplement-medieret drab; stammer, som mangler LPS kan dæmpes for virulens ^6-8. Af disse grunde er det vigtigt at visualisere LPS, især fra kliniske isolater. Visualisering LPS båndmønstre og anerkendelse af specifik enntibodies kan være nyttige værktøjer til at identificere stamme slægter og at karakterisere de forskellige mutanter.

I denne rapport beskriver vi en varm vandig phenol fremgangsmåde til isolering og oprensning af LPS fra Gram-negative bakterielle celler. Denne protokol muliggør ekstraktion af LPS væk fra nukleinsyrer og proteiner, der kan interferere med visualisering af LPS, der forekommer med kortere og mindre intensive ekstraktionsmetoder ^9. LPS fremstillet på denne måde kan adskilles ved natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og direkte farvet med carbohydrat / glycoprotein pletter eller faste sølvfarvning metoder. Mange anti-sera til LPS indeholde antistoffer, som krydsreagerer med ydre membran-proteiner eller andre antigene mål, som kan hæmme reaktivitet blev observeret efter Western immunoblot af SDS-PAGE-separerede rå cellelysater. Proteasebehandling af rå cellelysater alene ikke altid en effektiv måde at fjerne dennebaggrund ved hjælp af denne eller andre visualisering metoder. Yderligere kan store proteasebehandling i et forsøg på at fjerne denne baggrund føre til dårlig kvalitet LPS, som ikke kan løses ved enhver af de førnævnte fremgangsmåder. Af disse grunde mener vi, at følgende protokol, tilpasset fra Westpahl og Jann ^10, er ideel til LPS ekstraktion.

Protocol

1. Fremstillinq af bakterier til LPS Ekstraktion Begynder en overnatskultur i 5 ml Luria Broth (LB), suppleret med antibiotika, hvis nødvendigt. Vokser kultur natten over (12-18 timer) i en rysteinkubator ved 37 ° C og 200 rpm. Fortynd kulturen 1:10 med LB og tage en OD600 aflæsning i et spektrofotometer. Baseret på OD600 aflæsning, en 1,5 ml suspension af Deres bakterier gør en OD600 på 0,5. Pellets af bakterier i en mikrocentrifuge ved 10.600 x <em…

Discussion

Vi har beskrevet en fremgangsmåde til oprensning af LPS fra andre cellulære bestanddele, herunder nukleinsyrer og proteiner. Denne fremgangsmåde tilvejebringer høj kvalitet LPS, som kan anvendes i en række forskellige visualisering metoder, herunder carbohydrat farvning af SDS-PAGE-geler, som vist i figur 1. Denne fremgangsmåde kan anvendes til serotype LPS fra forskellige stammer ved anvendelse af specifikke anti-sera, eller at vise slægtskab mellem isolater ved direkte visualisering. For eksempel fra en nylig g…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	04716728001
RNase A	Roche	10109169001
Proteinase K	Fisher	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes	P20495