Rensing og Visualisering av lipopolysakkarid fra Gram-negative bakterier ved Hot Vandig-fenol Extraction

Summary

Vi beskriver en modifisert hot vandig-fenol utvinning metode for rensing av lipopolysakkarid (LPS) fra Gram-negative bakterier. Når utvinnes, kan LPS bli senere analyseres av SDS-PAGE og visualisert ved direkte farging eller vestlig immunoblot.

Abstract

Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig komponent av Gram-negative bakterielle ytre membranene. Det er en tredelt molekyl som består av lipid A, som er innebygd i den ytre membranen, en kjerne oligosakkarid og repeterende O-antigen enheter som strekker seg utover fra overflaten av cellen ^{1, 2.} LPS er en immunodominant molekyl som er viktig for virulens og patogenese av mange bakteriearter, inkludert Pseudomonas aeruginosa, Salmonella arter, og Escherichia coli ^3-5, og forskjeller i LPS O-antigen sammensetning danner grunnlaget for serotyping stammer. LPS er involvert i vedlegg til vertsceller ved initiering av smitte og gir beskyttelse mot komplement-mediert drap, stammer som mangler LPS kan dempes for virulens ^6-8. Av disse grunner er det viktig å visualisere LPS, spesielt fra kliniske isolater. Visualisere LPS banding mønstre og anerkjennelse ved spesifikk enntibodies kan være nyttige verktøy for å identifisere belastningsskader linjene og å karakterisere ulike mutanter.

I denne rapporten beskriver vi en varm vandig-fenol metode for isolering og rensing av LPS fra Gram-negative bakterielle celler. Denne protokollen tillater utvinning av LPS unna nukleinsyrer og proteiner som kan forstyrre visualisering av LPS som skjer med kortere, mindre intensive hentingsmetodene ^9. LPS forberedt på denne måten kan skilles ved natrium dodecyl sulfat (SDS)-polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) og direkte beiset med karbohydrater / glykoprotein flekker eller standard sølv flekker metoder. Mange anti-sera til LPS inneholde antistoffer som kryssreagerer med ytre membran proteiner eller andre antigene mål som kan hindre reaktivitet observert etter Western immunoblot av SDS-PAGE-skilt råolje celle lysates. Protease behandling av råolje celle lysates alene er ikke alltid en effektiv måte å fjerne dettebakgrunn bruker denne eller andre visualisering metoder. Videre kan utstrakt protease behandling i et forsøk på å fjerne denne bakgrunn føre til dårlig kvalitet LPS som ikke er godt løst av noen av de nevnte metodene. Av disse grunner, mener vi at følgende protokoll, tilpasset fra Westpahl og Jann ^10, er ideelt for LPS utvinning.

Protocol

1. Utarbeidelse av bakterier for LPS Extraction

1. Begynn en overnatting kultur i 5 ml Luria buljong (LB), supplert med antibiotika hvis nødvendig. Grow kultur natten (12-18 timer) i en rystelse inkubator ved 37 ° C og 200 rpm.
2. Fortynn kulturen 01:10 med LB og ta en OD ₆₀₀ lesing i et spektrofotometer. Basert på OD ₆₀₀ lesing, foreta en 1,5 ml suspensjon av bakterier til en OD ₆₀₀ på 0,5.
3. Pellet bakterier i en mikrosentrifuge på 10 600 x gi 10 minutter. Fjern og kast supernatanten. Den pellet kan oppbevares ved -20 ° C, hvis LPS ikke kommer til å bli utvunnet umiddelbart.

2. Utvinning av LPS

1. Først forberede 2x SDS buffer. Lag en 50 mL løsning av 4% β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS og 20% ​​glyserol i 0,1 M Tris-HCl, 6,8 pH. Legg til en klype Bromophenol blå å farge løsningen. Lag en 1x SDS-buffer lager ved å fortynne 2X stakk 01:01 i sterilt destillert H ₂ O. Dette kan lagres i romtemperatur.
2. Lag tre separate 10 mg / ml løsninger av DNase I, RNase, og Proteinase K i sterilt destillert H ₂ O.
3. Resuspender de pelleterte bakterier fra trinn 1,3 i 200 mL av 1x SDS-buffer. Sørg for at pellets er helt resuspendert ved pipettering løsningen opp og ned sakte. Ikke virvle.
4. Kok suspendert bakterier i et vannbad i 15 minutter. La løsningen avkjøles i romtemperatur i 15 minutter.
5. Tilsett 5 mL av både DNase I og RNase løsninger utarbeidet i 2.2. Inkuber prøvene ved 37 ° C i 30 minutter. * Dette trinnet er valgfritt, og det er minimal forskjell i kvaliteten på LPS mellom nuklease behandlet og ubehandlet prøver.
6. Tilsett 10 mL av Proteinase K løsning utarbeidet i 2.2. Inkuber prøvene ved 59 ° C i 3 timer. Dette trinnet kan utføres over natten, hvis det er tidspress.
7. For hver prøve, annonsed 200 mL av iskald Tris-mettet fenol (vannmettet fenol kan brukes som en erstatning hvis Tris-mettet fenol er ikke tilgjengelig). Sørg for at hettene på rørene er ordentlig stengt, og Vortex hver prøve for ca 5 til 10 sekunder.
8. Inkuber prøvene ved 65 ° C i 15 minutter, virvling og til. Etter inkubasjon avkjøles til romtemperatur, og deretter legge en mL romtemperert dietyleter til hver prøve og vortex i 5 til 10 sekunder. Sørg for å utføre håndtaket eter i en avtrekkshette, som det er flyktig.
9. Sentrifuger prøver ved 20 600 x gi 10 minutter. Fjern forsiktig prøver fra sentrifugen og pakke den nederste blå laget. Sørg for å unngå den øvre, klare laget. Etterlater en liten mengde av det blå laget er å foretrekke fremfor forurensning med det øvre laget.
10. Re-pakke prøvene ved å gjenta trinn 02.07 til 02.09. To ekstraksjoner er vanligvis tilstrekkelig. Hvis prøvene vises skyet, kanskje mer uttrekk være performed. Tilsett 200 mL av 2x SDS-buffer til hver av de utpakkede prøvene før separasjon av SDS-PAGE. Prøver kan kjøres på 8% -15% SDS-polyakrylamid geler. Fem til femten mL av LPS utarbeidet ved hjelp av denne metoden er vanligvis tilstrekkelig for visualisering.

3. Representative Resultater

LPS prøver forberedt som ovenfor kan visualiseres ved direkte farging følge separasjon på SDS-PAGE ved hjelp av en standard sølv-flekker protokoll eller en kommersielt tilgjengelig LPS farging kit. Alternativt kan LPS separeres på en polyakrylamid gel bli overført til en nitrocellulose membran og utsatt for vestlig immunoblotting hjelp LPS-spesifikk anti-sera. For denne protokollen har vi brukt Pro-Q Emerald 300 lipopolysakkarid Gel Stain Kit (molekylære prober), og fulgte produsentens anvisninger.

Vist i figur 1 er en Pro-Q Emerald 300 beiset 12% SDS-polyakrylamid gel. Hver kjørefelt inneholder 15 mL av LPS forberedt fra forskjellige stammer av Burkholderia dolosa isolert fra sputum prøver av pasienter med cystisk fibrose. Ulike LPS banding stige mønstre, reflekterende av ulike tall O-antigen gjentatte enheter knyttet til kjernen oligosakkarid, er tydelig å bruke denne metoden, for eksempel, prøver i kjørefelt 1 og 6 har lignende banding mønstre til hverandre (boxed i rødt).

Figur 1. Pro-Q Emerald 300 beiset LPS fra Burkholderia dolosa kliniske isolater. LPS fra syv B. dolosa stammer fra et utbrudd i cystisk fibrose pasienter ble isolert som beskrevet i denne protokollen. Femten mL ble separert på en 12% SDS-polyakrylamid gel, og beiset med Pro-Q Emerald 300, per produsentens instruksjoner. LPS kjerne er indisert en pil, og LPS viser liknende banding mønstre av O-antigen gjentar er boxed i rødt. M = Molekylvekt markør.

Discussion

Vi har beskrevet en metode for rensing LPS unna andre cellulære komponenter, inkludert nukleinsyrer og proteiner. Denne metoden gir høy kvalitet LPS som kan brukes i en rekke ulike visualisering metoder, inkludert karbohydrat farging av SDS-PAGE geler, som vist i Figur 1. Denne metoden kan brukes til å serotype LPS fra en rekke stammer, med bestemte anti-sera, eller å vise slektskap mellom isolatene ved direkte visualisering. For eksempel, en fersk genom-wide sekvensering prosjekt i kombinasjon med LPS karakterisering fra et utbrudd av B. dolosa førte til oppdagelsen av en enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) som korrelerer med tilstedeværelse og fravær av LPS i disse stammene ^11. Vi tror at denne metoden er å foretrekke fremfor protease behandling av hel-celle lysates beskrevet av Hitchcock og Brown ^9, da det er en relativt rask, men likevel grundig nok til å gi høy kvalitet LPS for videre analyses.

Mens vi bare vise et eksempel med Burkholderia dolosa, kan denne protokollen tilpasses andre Gram-negative arter også. Vi har med hell brukt denne protokollen til å trekke ut og visualisere LPS fra andre Burkholderia spp.., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa og Salmonella spp.. Dersom protokollen resultatene i liten eller ingen LPS avkastning, kan det være at LPS fractionates til et annet lag i utvinning trinn, 02.07 til 02.09. For å feilsøke dette, gjentar protokollen og lagre en prøve av hvert lag i løpet av utvinning trinnene, kan disse bli visualisert ved farging en SDS-PAGE gel for å fastslå hvor LPS fractionates, og protokollen kan endres tilsvarende. Det bør også bemerkes at denne protokollen, mens ideell for analytiske formål, ikke gir LPS som er egnet for andre applikasjoner, for eksempel strukturelle analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase I recombinant, RNase-free	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
Proteinase K	Fisher Scientific	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes, Life Technologies	P20495