Vi beskriver en modifisert hot vandig-fenol utvinning metode for rensing av lipopolysakkarid (LPS) fra Gram-negative bakterier. Når utvinnes, kan LPS bli senere analyseres av SDS-PAGE og visualisert ved direkte farging eller vestlig immunoblot.
Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig komponent av Gram-negative bakterielle ytre membranene. Det er en tredelt molekyl som består av lipid A, som er innebygd i den ytre membranen, en kjerne oligosakkarid og repeterende O-antigen enheter som strekker seg utover fra overflaten av cellen 1, 2. LPS er en immunodominant molekyl som er viktig for virulens og patogenese av mange bakteriearter, inkludert Pseudomonas aeruginosa, Salmonella arter, og Escherichia coli 3-5, og forskjeller i LPS O-antigen sammensetning danner grunnlaget for serotyping stammer. LPS er involvert i vedlegg til vertsceller ved initiering av smitte og gir beskyttelse mot komplement-mediert drap, stammer som mangler LPS kan dempes for virulens 6-8. Av disse grunner er det viktig å visualisere LPS, spesielt fra kliniske isolater. Visualisere LPS banding mønstre og anerkjennelse ved spesifikk enntibodies kan være nyttige verktøy for å identifisere belastningsskader linjene og å karakterisere ulike mutanter.
I denne rapporten beskriver vi en varm vandig-fenol metode for isolering og rensing av LPS fra Gram-negative bakterielle celler. Denne protokollen tillater utvinning av LPS unna nukleinsyrer og proteiner som kan forstyrre visualisering av LPS som skjer med kortere, mindre intensive hentingsmetodene 9. LPS forberedt på denne måten kan skilles ved natrium dodecyl sulfat (SDS)-polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) og direkte beiset med karbohydrater / glykoprotein flekker eller standard sølv flekker metoder. Mange anti-sera til LPS inneholde antistoffer som kryssreagerer med ytre membran proteiner eller andre antigene mål som kan hindre reaktivitet observert etter Western immunoblot av SDS-PAGE-skilt råolje celle lysates. Protease behandling av råolje celle lysates alene er ikke alltid en effektiv måte å fjerne dettebakgrunn bruker denne eller andre visualisering metoder. Videre kan utstrakt protease behandling i et forsøk på å fjerne denne bakgrunn føre til dårlig kvalitet LPS som ikke er godt løst av noen av de nevnte metodene. Av disse grunner, mener vi at følgende protokoll, tilpasset fra Westpahl og Jann 10, er ideelt for LPS utvinning.
Vi har beskrevet en metode for rensing LPS unna andre cellulære komponenter, inkludert nukleinsyrer og proteiner. Denne metoden gir høy kvalitet LPS som kan brukes i en rekke ulike visualisering metoder, inkludert karbohydrat farging av SDS-PAGE geler, som vist i Figur 1. Denne metoden kan brukes til å serotype LPS fra en rekke stammer, med bestemte anti-sera, eller å vise slektskap mellom isolatene ved direkte visualisering. For eksempel, en fersk genom-wide sekvensering prosjekt i kombinasjon med LPS karakteriseri…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health og Cystisk fibrose Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
RNase A | Roche | 10109169001 |
Proteinase K | Fisher | BP1700 |
Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |