Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas
Summary
Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 × 10<sup> 8</sup> Células por la preparación con la viabilidad celular entre 88 ~ 96%.
Abstract
Cultivo de hepatocitos primaria es una herramienta valiosa que ha sido ampliamente utilizado en la investigación básica de la función hepática, la enfermedad, fisiopatología farmacología, y otros temas relacionados. El método basado en la perfusión de colagenasa de dos pasos para el aislamiento de hepatocitos intactos se introdujo por primera vez por Berry y Friend en 1969 1 y, desde entonces, ha sufrido muchas modificaciones. La técnica más utilizada fue descrito por Seglenin 1976 2. Esencialmente, los hepatocitos se disocian de ratas adultas anestesiadas por una perfusión de colagenasa no recirculante a través de la vena porta. Las células aisladas se filtra a través de un filtro de 100 micras de tamaño de poro de malla de nylon, y se cultivaron en placas. Después del cultivo 4-horas, el medio se reemplazó con medio que contenía suero o suero libre, por ejemplo HepatoZYME-MSB, por el tiempo adicional a la cultura. Estos procedimientos requieren pasos quirúrgicos cultura y estéril que puede ser mejor demostrado por el vídeo que por texto. HERE, que documenta los pasos detallados para estos procesos, tanto por video y protocolo escrito, que permiten consistente en la generación de hepatocitos viables en grandes cantidades.
Protocol
Discussion
Cultivo primario de hepatocitos es un modelo in vitro utilizado para estudiar diversos aspectos de la fisiología y la patología del hígado. Por ejemplo, la cultura primaria se utiliza para evaluar la expresión y función de las enzimas que metabolizan las drogas incluyendo los citocromos P450, el metabolismo de drogas, las interacciones fármaco-fármaco, y los mecanismos de citotoxicidad y genotoxicidad 3-7. El protocolo que describe el aislamiento y cultivo de las células hepáticas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Sr. Josh Basford y el Dr. Li Xiao-min para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH (DK70992 y DK92779 a ML).
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
- Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
- Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
- Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
- Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
