開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

Summary

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。

Abstract

胚の脊髄は中枢神経系（CNS）のニューロンとグリア細胞の大部分を生じさせる神経前駆細胞をサイクリングで構成されています。ずっとそのパターン脊髄を分子メカニズムについて知られ、ニューロンの分化^1、2を引き出すされていますが、我々は、細胞の挙動のレベルでこれらの初期のイベントの深い理解を欠いている。彼らは神経を受けると、それはリアルタイムで神経前駆細胞の挙動を研究するため、非常に重要です。

過去には、初期胚組織のリアルタイムイメージングは​​、細胞/組織培養中の生存率と同様に蛍光イメージングの光毒性影響によって制限されていました。ここでは、新規のex vivoでのスライス培養プロトコルと広視野蛍光顕微鏡（ 図1）を利用し 、長時間のイメージングなどの組織のための新規アッセイ法を提示します。このアプローチでは、ニワトリ胚の長期的な時間経過のモニタリングを実現高い空間分解能と時間分解能を持つピナル脊髄前駆細胞。

このアッセイは、画像に携帯電話とサブセルラー行動の観察に加えて、胚組織^3、4の範囲を変更することができ、遺伝子活性のための新規の開発と高感度レポーター（例えば、Notchシグナル伝達^5）は 、このアッセイを行うシグナル伝達を理解するための強力なツールでは、胚発生過程における細胞挙動を制御します。

Protocol

1。料理の準備

1. スライス培養に使用される料理は（WillCo料理）（ベースとしてカバースリップ付き）ガラス底です。これらはガラスの底をきれいに保つために6 cmの組織培養皿にレンズの組織に配置されています。
2. 実験前日に、ポリ-L-リジンコートのガラス底をに可能にするために室温で5分間ガラスボトムディッシュとインキュベートし、2 mlの0.1％のポリ-L-リジン溶液を追加します。
3. ポリ-L-リジン溶液を除去し、脱イオン水で、その後一度70％エタノールで3回すすいでください。
4. 一晩乾燥させたままにします。料理も穏やかに30〜45秒のために低消費電力で電子レンジで加熱することによって乾燥させることができる。

2。胚のエレクトロポレーション

1. °Cハンバーガー·ハミルトン（HH）ステージ10（〜36時間）（または他の所望の段階）に37℃で卵をインキュベートします。
2. ガラス針を（我々は燃える/ブラウンモデルP87マイクロキャピラリープラーを使用します）準備しneedlの先端を切り離し始める前に解剖顕微鏡下で微細な鉗子を使用して電子。それはDNA溶液の注入を妨げるように狭くされていないが針の終わりには胚を貫くのに十分なシャープでなければなりません。
3. 胚のいずれかの側の窓の卵と場所電極（5mm離れ）
4. 神経管に - DNA（ファストグリーンの少量で着色された脱イオン水で0.5μg/μLの〜0.025）を注入します。
5. 現在適用されます - パルス間の950ミリ秒と12月17日V三回、50msのパルスの長さ。
6. 我々は個々のセルに従うことができるようにモザイクの発現を達成するためにDNAの低濃度、低エレクトロポレーション電圧を使用しています。
7. セロテープで卵殻の窓をカバーし、それが密閉されていることを確認します。
8. 胚は37℃で3-4時間または一晩で回復することができ℃の

3。コラーゲンとスライス培養培地の調製

1. スライスする前に、時間に関するコラーゲンミックスとスライス培養培地を準備します。
2. 300μlのtにYPE 1コラーゲンは、100μlの0.1％酢酸溶液と100μlの5×L15培地を追加します。徹底的に各添加後ボルテックス。溶液は黄色に変わります。
3. 今15から20μlの7.5％炭酸水素ナトリウムと徹底的に渦を追加します。解決策は、少しピンクになるべきであり、このために必要な重炭酸ナトリウムの量が異なる場合があります。氷上に置き、毎回新鮮な構成しています。
4. 10ミリリットルneurobasal培地に1×の最終濃度と10μlのゲンタマイシン液にB-27サプリメントとグルタミンを追加します。
5. 37℃インキュベーター内で場所媒体は、5％CO ₂で緩衝。それはCO ₂と平衡できるようにするためにコンテナの上部が緩いままにしておきます。

4。スライス培養

1. 卵から胚を取り出して、L15培地で洗ってください。
2. 下部にsylgardの層での組織培養皿で行われ、それらがピンと張ったストレッチされるように、周囲の余分な胚膜を介してそれらをピン。
3. マイクを使用して、roknife、関心領域を介して、できるだけまっすぐにスライス胚。脊髄では、スライスの厚さは1から2体節の間でなければなりません。あなたがそれらを失うことはありませんので、他の胚をスライスしながら胚に接続されているスライスのままにしておきます。
4. 〜先端の1ミリメートルを切断し、P2またはP10にこれを取り付けることにより、200μlのマイクロピペットチップを準備します。このチップは、ガラスボトムディッシュに脊髄スライスを転送するために使用されます。 10μlの先端は、スライスをピックアップするのに十分広いではありません。
5. コー​​ト前に準備1μlのコラーゲンミックスをピペッティングによるコラーゲンの先端の内側。 L15培地でリンスし、1から2分放置します。これは、先端の内側に付着したから組織を防ぐことができます。
6. microknifeを使用して、胚からスライスをデタッチし、200μlの先端を装備し、1μlにセットP2またはP10を使用して、皿から削除します。できるだけ媒体として取るようにしてください。
7. 渦コラーゲンミックスとポリ-L-リジンコートしたディッシュにこのの5-8μlをドロップします。
8. Immediately細かい鉗子のペアを使用して所定の位置にコラーゲンや位置に胚のスライスを入れた。スライスが撮像される側はカバースリップの端が揃うように配置する必要があります。組織は、カバースリップ上にポリ-L-リジンコーティングに付着する必要があります。
9. あなたがカバースリップ上で複数のスライスを持ってまで、この手順を繰り返します。我々は、通常1皿に6から9のスライスを配置することができます。
10. すべてのスライスを配置したら、皿をカバーし、コラーゲンが20分に設定することができます。最古の置かれたコラーゲンのいくつかはすでに乾き始めている場合があります。防ぐために、これがカバーする前に、これらにL15の少量を追加します。
11. 一度、設定を慎重に少なくとも1時間は37℃、5％CO ₂で平衡化された2ミリリットルスライス培養培地を追加します。注意はカバースリップからコラーゲンを取り除くないように注意する必要があります。
12. 37℃/ 5％CO ₂インキュベーター内での場所とスライスがイメージを作成する前に少なくとも3時間で回復することができます。パースペックスボックスのウィットには湿度がない場合は、場所の皿1コーナーで湿らせたティッシュペーパーのHAビット。

5。イメージング胚スライス

1. 我々は、画像スライスにWeatherStationの環境室を装備しDeltaVisionコア広視野顕微鏡を使用しています。室は常に5％CO _2/95％空気で顕微鏡ステージを維持するためにCO ₂灌流装置を用いて37℃に維持されています。
2. イメージングは​​、通常、40×/ 1.30 NA油浸レンズと画像を用いて行われるCCDカメラを冷却CoolSnap HQ2で撮影されています。
3. Z-セクションは、45μmの組織を介して、1.5μmのキャプチャされます。露光時間は可能な限り低く抑える必要があります。我々は通常、各Z-セクションの5から50ミリ秒間公開しています。画像は7分間隔で取得され、最大9つのスライスは、関数を訪れDeltaVisionシステムの正確なポイントを使用して訪問することができます。

6。代表的な結果

脊髄前駆細胞の例は時間経過のシーケンスは、図に示す。 2aと対応するムービー1。イメージングは​​2日齢（HHステージ12）胚から脊髄スライスに開始されました。このセルは、GFP-αTubulinを表現する構築物でトランスフェクトした。この初期の段階では、神経前駆細胞は主として細胞が2さらに循環前駆細胞を生成するために分割し、その間前駆-前駆モードの部門を受けています。 図。 2bと対応するムービー2は、細胞膜をマーク、GFP-GPI（GPIは、GFPを固定）でトランスフェクトした細胞を示しています。この細胞は、基底のプロセスが二つに分割し、均等に娘細胞に継承されている間分裂を受ける。

図1。タイムラプスイメージングのためのスライス培養プロトコル。

図2。セルB正常な脊髄の開発中にehavior。 ムービー1から（1）選択したフレーム。 GFP-チューブリンを発現する細胞は、再び（24時間23分と25時間54分）に分割二つの娘細胞を生成し、先端面（2時間20分）に垂直な切断面で分割されます。 （b）の動画2から選択したフレーム。 GFP-GPIをトランスフェクト細胞は、基底のプロセスを分割し（白矢印）と同様に娘細胞に継承され、その間に細胞分裂を受ける。

映画は1。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。

ムービー2 ムービーを表示するには、ここをクリック 。

Discussion

ここではニワトリ胚スライス培養における細胞の挙動を監視するための新たなタイムラプスイメージングアッセイを提示します。 24-48時間の間の時間フレームをキャプチャすることが容易であるが、このアッセイでは、最大70時間の生体組織の高分解能イメージングを可能にします。高NA油浸対物と時間点の間の比較的短い間隔での使用は同様に私たちはしばしば急速に発生する細胞の挙動を監視することができますように、高解像度での画像取得を可能にし、容易に焦点を用いた従来のタイムラプスイメージング中に見逃されることができ顕微鏡。

このアッセイの主な利点は、長期間にわたって画像セルの能力である。 ⁷顕微鏡を共焦点レーザーの代わりにワイドフィールド⁶の使用はこのために重要です。共焦点顕微鏡は、従来の光学切片をとり、直接フォーカス情報のうち、排除する能力を含む、広い視野顕微鏡に比べていくつかの利点を提供してきました8への光の損失につながる。広視野顕微鏡は、他の一方で、完全な視野照明を使用して、目的を介してすべての通過する光は、検出器に送られます。高い量子効率を持つこの結合は、結合素子（CCD）カメラ、非常に高速な露光時間と共焦点顕微鏡⁹に比べて対ノイズ比の高い信号を画像処理を確実に冷却した。このアプリケーションでは、我々は長い期間、記録の3Dスタック、最終的に小型に近い回折制限された構造を解決するためのイメージする必要があります。共焦点顕微鏡は、これまでに検出器に到達するからアウトフォーカスの光を防ぎ、大幅に厚い、高密度で標識した試料^7、8のバックグラウンドを減少させるが、それだけでよりもはるかに大きな光入力で使用可能な信号対雑音比を実現ワイドフィールド顕微鏡^10。非常に光に敏感なsparselのために私たちのエレクトロ脊髄のスライスのようにy軸ラベルのサンプルは、したがって、広い視野顕微鏡は、共焦点顕微鏡よりもパフォーマンスが向上します。フォーカス情報と向上し、コントラストの外に除去しデコンボリューションによって、イメージの復元と組み合わせると、広いフィールドが、小さな、薄暗いオブジェクト¹¹の検出に特に適しています。あらゆる組織のイメージング実験には適していませんが、このアプローチは、私たちの生細胞イメージングアプリケーションのための非常に有効であった。

蛍光タンパク質の選択は、細胞の生存に影響を与えることができる重要な要因である。我々は最良の結果がマーカーとして緑色蛍光タンパク質^{（GFP）12を}使用^して構造体から得られることがわかります。我々は現在、事実上のデュアルチャネルの時間経過のためにGFPと組み合わせて使用​​することができる赤色蛍光タンパク質の範囲を評価しています。 ¹³利用できるようなタンパク質の様々なものがあります。多くのタンパク質は、蛍光タンパク質との融合体として安定しているが、、いくつかのタンパク質が減少し、細胞生存率の結果、融合によって不安定にレンダリングすることができます。このような場合には、内部リボソーム侵入部位（IRES）を含む構造体の使用は、蛍光タンパク質から目的のタンパク質を分離するのに便利です。

イメージング脊髄スライスする場合は、注意が蛍光灯への暴露を最小限に抑えるように注意する必要があります。顕微鏡の接眼レンズは、スライスを見つけて位置する透過光（明視野）でのみ使用する必要があります。蛍光画像は、常に最小の露光時間を使って顕微鏡ソフトウェアを使用して取得する必要があります。これらは5から50 msの範囲に保たれるべきであり、中立的な密度のフィルタの使用で実験する必要があります。長い露光時間が最初にクリアな画像を生成するかもしれませんが、蛍光灯暴露の光毒性効果は、細胞死につながる可能性があります。この地域は中に損傷されている可能性があり、組織が含まれているカバースリップに最も近い組織の最初の5〜10μmの撮像すべきではありませんスライス。

ここで示す例は、HHステージ10以降撮像された6-7時間でエレクトロ胚のですが、このメソッドは、ステージ18をHHに胚用に使用することができます。後の段階で、脊髄組織がはるかに大きいので、手でスライスすることは困難である。これらのケースでは、低融点アガロースで胚を埋め込み、ビブラトームで切片と良い結果をもたらす可能性があります。我々が開発して脊髄のイメージング細胞の方法として、このアッセイを提示するにもかかわらず、このアプローチはまた、感覚placodes ^3を含むイメージを他の胚組織に変更されています。