Imaging embryonale vev i sanntid er utfordrende over lange perioder. Her presenterer vi en analyse for overvåking cellulære og sub-cellulære endringer i chick ryggmargen for lange perioder med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Denne teknikken kan tilpasses for andre regioner i nervesystemet og utvikling av embryo.
Den embryonale Ryggmargen består av sykling nevrale stamceller som gir opphav til en stor andel av de nevrale og gliaceller i sentralnervesystemet (CNS). Selv om mye er kjent om de molekylære mekanismene som mønster ryggmargen og framprovosere neuronal differensiering 1, 2, mangler vi en dyp forståelse av disse tidlige hendelser på nivået av cellen oppførsel. Det er derfor viktig å studere oppførselen til nevrale stamceller i sanntid som de gjennomgå neurogenesis.
I det siste, sanntids avbildning av tidlig embryoutvikling vev har vært begrenset av celle / vev levedyktighet i kultur samt fototoksiske effektene av fluorescerende bildebehandling. Her presenterer vi en ny test for bildebehandling slikt vev i lange perioder, bruk en roman ex vivo skive kultur protokoll og bredt felt fluorescens mikroskopi (Fig. 1). Denne tilnærmingen oppnår langsiktig time-lapse overvåking av chick embryonale sPinal ledningen stamceller med høy romlig og tidsmessig oppløsning.
Denne analysen kan modifiseres til bilde en rekke embryonale vev 3, 4 I tillegg til observasjon av cellulære og sub-cellulær atferd, utvikling av romanen og svært sensitive journalister for genaktivitet (for eksempel Notch signalering 5) gjør denne analysen et kraftig verktøy til å forstå hvordan signaliserer regulerer celle oppførsel under embryonal utvikling.
Vi presenterer her en roman time-lapse bildebehandling analysen å overvåke celle atferd i kylling embryonale skive kultur. Denne analysen gir høy oppløsning av levende vev for opptil 70 timer, selv om tidsrammer mellom 24-48 timer er lettere å fange. Bruken av en høy NA olje objektiv og relativt korte intervaller mellom tid-poeng gjør at bildet oppkjøpet i høy oppløsning, samt at vi kan overvåke celle atferd som ofte skjer raskt, og kan lett overses ved konvensjonell time-lapse avbildning ved hjelp confocal mikroskopi.
Den store fordelen med denne analysen er evnen til bildet celler over lange perioder. Bruk av brede felt 6 i stedet for confocal laserskanning 7 mikroskopi er kritisk for dette. Konfokalmikroskopi har tradisjonelt tilbudt flere fordeler fremfor bredt felt mikroskopi, inkludert muligheten til å ta optiske seksjoner og eliminere ut av fokus informasjon direkte <sup> 7, men bruk av et pinhole fører til tap av lys til detektoren 8, unntatt en betydelig mengde informasjon, og nødvendiggjør lengre eksponeringstider. Wide-field mikroskopi, derimot, bruker full felt belysning og alt lyset som passerer gjennom målet er sendt til detektoren. Dette kombinert med en høy Quantum effektiviteten avkjølt kombinert enhet (CCD) kamera sørger bildebehandling med høy signal til støyforhold i forhold til konfokalmikroskopi 9, med svært raske eksponeringstider. I søknaden vår, må vi bilde i lange perioder, ta opp 3D stabler og til slutt løse små nær-diffraksjon begrensede strukturer. Selv konfokalmikroskopi hindrer ut-av-fokus lys fra noensinne å nå detektoren og dermed reduserer bakgrunn i tykke, tette-merket prøver 7, 8, oppnår det bare en brukbar signal-til-støy-forhold med mye større lys inngang enn bred- felt mikroskopi 10. For veldig lysømfintlig sparsely-merket prøvene som våre electroporated ryggmarg skiver, derfor utfører bredt felt mikroskopi bedre enn konfokalmikroskopi. Når det kombineres med bilde restaurering av deconvolution, fjerner noe ut av fokus informasjon og forbedrer kontrasten, wide-feltet er så spesielt bra for påvisning av små, dim gjenstander 11. Selv om ikke egnet for alle vev avbildning eksperiment, har denne tilnærmingen vært svært effektive for vår live celle bildebehandling søknad.
Valget av fluorescerende protein er en viktig faktor som kan påvirke celle overlevelse. Vi finner at de beste resultatene er hentet fra konstruksjoner som bruker grønn fluorescerende protein (GFP) 12 som en markør. Vi vurderer for tiden en rekke røde fluorescerende proteiner som kan brukes effektivt i kombinasjon med GFP for dual channel time-bortfaller. Det finnes en rekke slike proteiner tilgjengelige 13. Selv om mange proteiner er stabilt som fusjoner med et fluorescerende proteinKan noen proteiner gjengis ustabil ved fusjon, noe som resulterer i redusert celle levedyktighet. I slike tilfeller er bruk av konstruksjoner som inneholder en intern ribosomet oppføring hotellet (IRES) nyttig å skille protein av interesse fra fluorescerende protein.
Når bildebehandling ryggmarg skiver, må man sørge for å minimere eksponering for fluorescerende lys. Mikroskopet okularer må bare brukes med overført lys (lysfelt) for å finne og posisjon skiver. Fluorescent bilder bør alltid være anskaffet ved hjelp av mikroskop programvaren ved hjelp av minimal eksponering ganger. Disse bør oppbevares i størrelsesorden 5-50 ms og bruk av nøytral tetthet filter bør eksperimentert med. Selv lengre eksponeringstider kan i utgangspunktet produsere klarere bilder, kan fototoksiske effektene av fluorescerende lys eksponering føre til celledød. De første 5-10 mikrometer i vev som er nærmest dekkglass bør ikke avbildes som denne regionen inneholder vev som kan ha blitt skadet underkutting.
Selv om eksemplene som presenteres her er av embryoer electroporated ved HH scene 10 og avbildes 6-7 timer senere, kan denne metoden benyttes for embryoer opp til HH scenen 18. Ved senere stadier, er ryggmargen vev mye større og så er vanskelig å skjære for hånd. I disse tilfellene kan bygge embryoene i lavt smeltepunkt agarose og seksjonering med en vibratome gi bedre resultater. Selv om vi presentere denne analysen som en metode for imaging celler i utviklingsland ryggmargen, har denne tilnærmingen også blitt modifisert til å ta bilder andre embryonale vev, inkludert den sensoriske placodes tre.
The authors have nothing to disclose.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
WillCo Dish | WillCo Wells | GWst-3522 | |
poly-l-lysine | Sigma | P8970 | 0.1% in Tris |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Instruments | GC100-10 | 1.0mm outer diameter, 0.58mm inner diameter |
Electrodes (Genetrodes, in ovo, L-shaped | BTX | 10-001850-01 | 5mm gold plated |
ECM 830 square pulse generator | BTX | 45-0002 | for in ovo electroopration |
Fast Green | Sigma | F7258 | |
Type I rat collagen | Sigma | C3857 | |
L-15 medium (powder) | Sigma | 2.76 g/L in distilled water for 5x solution |
|
Sodium bicarbonate | Sigma | S8761 | 7.5% solution |
Neurobasal medium | Invitrogen | 12348-017 | without phenol red |
Glutamax | Invitrogen | A1286001 | 100x solution |
B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15710049 | 10 mg/ml |
L15 medium (liquid 1x) | Invitrogen | 11415-049 | |
Microknife | Altomed | A10102 | 15 degree incline |
Stainless steel headless pins | Watkins and Doncaster | E6871 | A1 size |
Sylgard 184 elastomer | VWR | 634165S | |
DeltaVision Core microscope system | Applied Precision | ||
Coolsnap HQ2 CCD camera | Photometrics |