Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Summary

Raman-spektroskopi är en lämplig teknik för beröringsfri, etikett-fri analys av levande celler, vävnadstekniska konstruktioner och de infödda vävnader. Källspecifika kan spektrala fingeravtryck genereras och analyseras med multivariat analys.

Abstract

Icke-förstörande, icke-kontakt och märkning fritt teknik för att övervaka cell-och vävnadskulturer behövs inom biomedicinsk forskning. ^1-5 men för närvarande finns tillgängliga rutinmässiga metoder kräver bearbetning steg och ändra prov integritet. Raman-spektroskopi är en snabb metod som möjliggör mätning av biologiska prover utan behov av ytterligare bearbetningssteg. . Denna laser-baserad teknik upptäcker oelastiska spridning av monokromatiskt ljus ⁶ Eftersom alla kemiska vibration tilldelas ett specifikt Raman band (vågtal i cm ^-1), har varje biologiskt prov ett typiskt spektral mönster på grund av deras inneboende biokemiska sammansättning ^{7. - 9} Inom Raman spektra, de toppintensiteterna korrelerar med mängden av de nuvarande molekylära bindningar. ¹ Likheter och skillnader i de spektrala datamängder kan upptäckas genom att använda en multivariat analys (t.ex. principalkomponentanalys (PCA)). ¹⁰

Här utför vi Raman-spektroskopi av levande celler och infödda vävnader. Celler är antingen sås på rätter glas botten eller hålls i suspension under normala förhållanden cellodling (37 ° C, 5% CO ₂₎ före mätning. Naturliga vävnader dissekeras och lagras i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C före mätning. Beroende på vårt experimentella uppsättning, då vi antingen fokuserat på cellkärnan eller extracellulär matris (ECM)-proteiner, såsom elastin och kollagen. För alla studier är minst 30 celler eller 30 slumpmässiga punkter av intresse inom ECM mätas. Stegen för databearbetningen ingår bakgrundssubtraktion och normalisering.

Protocol

1. Framställning av det biologiska provet

1. Framställning av levande celler
   1. Framställning av adherenta celler
      1. Frö in vitro-odlade eller nyligen isolerade celler på ett glas nedre skålen (Greiner BioOne / Tyskland) och inkubera dem vid 37 ° C och _5% CO2 tills cellvidhäftning är fullbordad.
      2. Avlägsna odlingsmedium och tvätta försiktigt tre gånger med PBS före mätning. Hålla cellerna täckta med antingen PBS eller cellodlingsmediet genom hela mätförfarandet.
   2. Framställning av celler i suspension
      1. Lösgöra in vitro-odlade celler enligt vanliga protokoll (t.ex. trypsin-EDTA, celler skrapning), centrifugera cellerna och återsuspendera den erhållna cellpelleten i PBS eller cellodlingsmediet.
      2. Överför 100 | il av cellsuspensionen (koncentration: Max 100.000 celler / ml) till en glas nedre skålen.
2. Framställning av native vävnader
   1. Efter skörd av vävnaderna, överföra dem till steril iskall PBS och hålla dem längre än 12 timmar vid 4 ° C eller på is före mätning. Tidigare experiment har visat att en långvarig lagringstid (kall ischemi tid> 12 timmar vid 4 ° C) resulterade i spektrala förändringar på grund av naturliga nedbrytningsprocesser.
   2. Mätningarna skall utföras med vävnaden täckt av PBS eller medium för att undvika skador på ECM proteiner och celler på grund av vävnad torkning.

2. Raman-spektrometer

Vår anpassade Raman spektrometer kombinerar en vanlig fluorescensmikroskop (Olympus IX 71) med en Raman spektrometer som gör det möjligt direkt jämförelse av ljus-fält och fluorescens bilder med Raman spektra. Den grundläggande uppsättningen består av en 784 nm diodlaser (Toptica fotonik AG / Tyskland), en notchfilter för separation av den Raman-spritt ljus från excitationsljus, ett mikroskop ennd en spektrograf (Kaiser Optisk Systems Inc., Ann Arbor / USA) med en laddningskopplad anordning (CCD-kamera) optimerad för detektion av spektralinformationen (F-se från Soft Imaging Systems / Tyskland).

3. Kontroll av Laser funktion

1. Starta programmet Andor Solis (Andor / Storbritannien) och ställ in temperaturen på CCD-kameran till -60 ° C för att minimera buller som orsakas av termiskt inducerade strömmar i kameran.
2. Placera en kiselskiva på mikroskopet scenen för kalibreringen.
3. Slå på lasern på och ställ in strömmen till 85 mW.
4. Använd B-programvaran Cell (Olympus / Tyskland) för att fokusera lasern på skivan tills XY visas.
5. Mät kiselskivan med en enda integrering på 1 sek med en 60x luft mål.
6. Ändra enheten x-axeln från pixelantal till Raman-växling ^(cm-1) i Andor Solis mjukvara.
7. Variera lasern fokus kisel toppen vid 520 cm ^-1 idet uppsamlade spektrum för att hitta den högsta möjliga intensitet för detta Raman-band. Den minsta mängden räknas måste vara högre än 11.000 till få en lyckad kalibrering.

4. Raman-spektroskopisk Mätningar

Alla mätningar utfördes vid rumstemperatur.

1. Grundinställningar
   1. Använd en 60x objektiv nedsänkning i vatten (Olympus / Tyskland) med en numerisk apertur på 1,2 för att samla spektrum av proverna.
   2. Ändra förvärvet inställningarna till 10 integrationer / 10 sekunder för totalt 100 sekunder per mätningar.
2. Mätning av adherenta celler
   1. Ta skålen glaset botten med cellerna och placera den på mikroskopet scenen.
   2. För att få en bättre signal och se reproducerbarhet, fokusera lasern på cellkärnan, stänga av mikroskopet lampan och börja samla spektrumet.
   3. Mät en referens spektrum av bakgrunden emycket 10 spektra genom att flytta lasern fokus bredvid cellen. Det är viktigt att beakta att när man byter fokus en ny bakgrund ska samlas in för varje fokus djup.
3. Mätning av celler i suspension
   1. Överför 100 | il av cellsuspensionen i glaset nedre skålen och placera den på mikroskopställningen.
   2. Fokusera lasern på mitten av cellen, vänd mikroskopet lampan och börja samla in spektrumet.
   3. Mäta ett referensspektrum för bakgrunden var 10 spektra genom förflyttning av lasern fokus vid cellen. Vid byte av fokus, måste en ny bakgrund samlas in för den nya inriktningen djup.
4. Mätning av naturliga vävnader
   1. Ta provet och placera den i ett glas nedre skålen. Regionen av intresse (ROI) bör vara orienterad mot botten av skålen.
   2. Fyll skålen med tillräckligt PBS för att täcka provet.
   3. Placera ett täckglas över provet för att undvika movement av provet under mätningar.
   4. Ställ lasern fokus i strukturen av intresse (djup upplösning är laser-och vävnads-beroende) och börja samla spektra.
   5. Samla ett referensspektrum för bakgrunden var 10 spektra genom förflyttning av lasern fokusera av hela vävnadsområdet. Vid byte av fokus, måste en ny bakgrund samlas in för den nya inriktningen djup.
5. Mätning av immunofluorescens (IF)-märkta kryosnitt
   1. § färska, snabbfrystes vävnadsprover med en vanlig cryotom och monterar dem på kiselbelagda täckglas.
   2. Fläck kryosnitten efter en rutin protokoll för IF, med användning av endast en kort fixeringssteget (max 10 minuter med 4% paraformaldehyd) och med användning av lämpliga antikroppar för detektion av proteinet av intresse.
   3. Utför Raman mätningar fokus i det område där fluorescensen sker.
6. Elastin nedbrytning experiment
   1. Place den ventricularis av de dissekerade ventil porcina aortamembran (elastin-rika, blod inflöde vänt skikt av hjärtklaffen bipacksedel) vetter mot botten av glaset nedre skålen.
   2. Mät den naturliga vävnaden som en "icke ruvade kontroll" på 30 slumpmässigt punkter över hela vävnadsytan fokus i fibrillära strukturer.
   3. Dela upp provet i 3 sektioner och placera dem i separata 2,5 ml Eppendorf-rör fyllda med 2 ml av en elastas-lösning (5 U / ml, Worthington / Tyskland).
   4. Inkubera vävnaden för antingen 15 eller 30 minuter vid 37 ° C.
   5. Efter inkubation under antingen 15 eller 30 minuter, avlägsna vävnader från Eppendorf-rör och tvätta noggrant med PBS för att fullständigt stoppa den enzymatiska reaktionen.
   6. Mät varje prov på 30 slumpmässigt punkter, med fokus på fibrillära strukturer.

5. Databehandling och analys

1. Raman-spektra bearbetning
   Förbehandling avgenererade spektra utfördes med hjälp OPUS mjukvara (Bruker Optik GmbH / Tyskland).
   1. För att minska interfererande signaler från glaset och mediet samt för att undvika variationer orsakade av förändringar i fokus under mätningar, subtrahera den motsvarande bakgrunden spektrum från den uppsamlade spektra.
   2. Minska spektra till vågtalet regionen mellan 400-1800 cm ^-1, vilket ger den högsta mängd information.
   3. Om det behövs, normalisera spektra till den maximala topp. Normaliseringsfaktorerna ut de intensitetsfluktuationer och systematiska misslyckanden, vilket förenklar upptäcka strukturella förändringar i provet spektra.
   4. Utför en baslinje korrigering för att öka jämförbarheten mellan olika experiment.
2. Raman-spektra analys
   Raman spektra analyserades med hjälp av PCA med The Unscrambler (CAMO / Norge) programvara. Detta multivariat analys påvisar skillnader och likheter inom de spektrala dataset. Varje spektrum ritas som en enda punkt i ett flerdimensionellt rum på grundval av de insamlade räknas för varje Raman skift. Varje princip komponent (PC) beskriver en viss mängd av den totala informationen i de ursprungliga uppgifterna. Den första PC är den som innehåller de högsta källan till variation. Varje följande PC innehåller i tur och ordning mindre information än den tidigare. Varje variabel har en poäng och en belastning på varje dator. Genom att rita datorer (= poäng), kan viktiga prov korrelationer exponeras. De belastningar beskriver bidraget från varje analyseras variabel till partnerskaps-och samarbetsavtalet.
   1. Märk varje grupp av mätningar genom att skapa raden intervall för varje prov grupp.
   2. Använd följande grundläggande inställningarna för PCA: korsvalidering, den NIPALS algoritmen, ingen rotation och starta analysen. Dessa inställningar är spektra beroende.
   3. Utför PCA.

6. Representativa resultat

Raman-spectra alstras från vidhäftande celler uppvisar ofta en låg signal-till-brusförhållande och en låg total signalintensitet (fig 1). ¹¹ Beroende på det faktum att lasern fokus måste sättas nära glasets botten, påverkan av interfererande glas-signalen är relativt hög, vilket orsakar maskering av det aktuella provet signalen. Följaktligen, kan urvalet signalen minimeras eller till och med elimineras under en efterföljande bakgrundssubtraktion. Sålunda föredrar vi att använda celler i suspension under vår Raman-spektroskopisk analys, eftersom de möjliggör detektering av mer detaljerad spektralinformation. Emellertid spektra av adherenta och suspensionen celler uppvisar samma huvudsakliga topparna skiljer sig endast i deras intensiteter.

För karakterisering av olika celltyper i en suspension, ingen förbehandling krävs. Medelvärdet Raman-spektra och standardavvikelserna för humana fibroblaster, mesenkymala stamceller (MSCs), kondrocyter och keratinocyter mätt i suspension äravbildas i figur 2. Alla Raman-spektra är på liknande sätt strukturerade, med toppar som härrör från typiska biomolekyler såsom proteiner, nukleinsyror och lipider (se tabell 1). ¹² För dessa celltyper, det spektrala området mellan 600 och 1800 ^cm-1 innehåller mest relevanta spektralinformation, av som tydliga skillnader kan detekteras mellan de olika celltyperna (Fig. 2A). Exemplariskt, betonade vi en spektral region (1280-1350 cm ^-1) visar tydliga strukturella skillnader, vilket är hänförligt till molekylära vibrationer av kollagen och lipider. I motsats härtill morfologiska analyser är inte lämpliga för identifiering och särskiljning av de flesta celler (fig. 2B-I). Medan skillnaden mellan kondrocyter och hudceller är observerbar (fig. 2D, H i förhållande till B, F och E, I), fibroblaster och MSC är svåra att separera med enbart ljusfält micrsocopiera (fig. 2B, F kontra C, G). ¹³

Raman-spektroskopisk analys av nativ vävnad, i synnerhet av ECM-proteiner, kräver att en ROI kan visualiseras genom ljusfält avbildning för att kunna fokusera på den respektive strukturen. För tilldelning av ett protein till en viss fingeravtryck spektrum genererade vi Raman spektra av kommersiellt tillgängliga rena proteiner och immunohistologically färgade kryosnitt. Här identifierade vi fingeravtrycket spektra av elastiska fibrer i naturliga vävnader jämföra frystorkat elastin och immunofluorescens-färgade kryosnitt använder en antikropp mot elastin. Eftersom elastin har en hög autofluorescens, vilket återspeglas i Raman spektra är dataanalys utmanande (Fig. 3A). För att minska den systematiska fel på grund av prov-specifika egenskaper såsom autofluorescens en lämplig behandling av de dataset är avgörande. I våra uppgifter enalyses använde vi normalisering för att eliminera betydligt högre signalstyrkan i rent elastin proteinet, och därmed kunde vi skapa jämförbara Raman spektra (Fig. 3B). Elastin är en av de mest stabila ECM proteiner i kroppen och är därför mycket svårt att bryta ned ^14. I vår experimentella uppsättning upp inducerade vi elastin nedbrytning i friska ventiler svin aortamembran genom att utföra en enzymatisk nedbrytning. Applicering av multivariat analys PCA, identifierade vi signifikanta skillnader mellan Raman-spektra av enzymatiskt behandlade prover och nativa kontroller (fig. 3C). Dessa spektrala skillnader observerades i laddningspositionen spektrumet vid 861, 1003 och 1664 ^cm-1. Väntade strukturella förändringar i elastin-innehållande fibrer på grund av längre exponeringstider till elastas visades av HART: s färgning (Fig. 4), som också återspeglas i en mer distinkta skiljas poäng kluster (figur 3C).

Figur 1. Genomsnittlig Raman spektra av fristående och vidhäftande fibroblaster.

Figur 2. (A) Medelvärde Raman-spektra och standardavvikelser för fyra olika primära isolerade celltyper (fibroblaster, MSC, kondrocyter och keratinocyter). Ramen belyser den spektrala regionen 1280 - 1350 cm ^-1 med strukturella skillnader. (BE) ljusfält bilder av lösgjorda (B) fibroblaster, (C) MSCs, (D) kondrocyter och (E) keratinocyter. Skalstrecket lika 20 pm. (Fl) ljusfält bilder av adherenta (F) fibroblaster, (G) MSCs, (H) kondrocyter och i) keratinocyter. Skala bar lika 200 nm.

Figur 3. (A) Raman spektra utan normalisering av lyophiliZed elastin (blå linje), immunofluorescens (IF)-märkta kryosnitt (orange linje) och elastiska fibrer (röd linje) som mäts inom infödda broschyrer aortaklaffen. Den höga signalen intensitet lyofiliserade elastin orsakas av autofluorescens. (B) Raman spektra efter normalisering för att eliminera systematiska fel. (C) Resultat och belastningar av jämförelsen mellan icke-behandlad kontroll (röd) och enzymatiskt nedbrutna (blå och gröna) elastiska fibrer inom den nativa vävnaden.

Figur 4. HART's-färgade grisaorta ventilbladen. Elastiska fibrer visualiseras i svart. (A) och (B) visar icke-behandlad kontroll och (C) och (D) visar vävnadsprover som hade exponerats för elastin-nedbrytande enzymet elastas för 30 min.

Vågtal i cm -1	Uppdrag 12
717-719	CN	Fosfolipider
785-788	DNA / RNA-baser, OPO ryggraden	DNA / RNA-
1003 - 1005	Fenylalanin	Protein
1220-1280	Amid III	Protein
1445-1447	CH 2	Protein / lipid
1655-1680	Amid IC = C-	Protein Lipid

Tabell 1. Raman-band som kan detekteras inuti spektra för alla celltyper (fibroblaster, MSC, kondrocyter och keratinocyter).

Discussion

Raman-spektroskopi är ett lämpligt verktyg för att analysera biologiska prover, såsom in vitro-odlade celler och ECM-proteiner såväl som celler i nativa vävnader. ^11,15,16 Här visade vi att denna icke-kontakt, kan etiketten utan teknik för diskriminering av olika celltyper och detektion av ECM proteinnedbrytning enbart baserat på den egentliga biomolekylära sammansättningen av dessa biologiska prover.

Den stora fördelen med Raman-spektroskopi är förmågan att icke-invasivt mäta den biokemiska fingeravtrycket av ett prov genom dess resulterande Raman-spektra. I motsats till infraröd spektroskopi, vilket ger motsvarande information, kan Raman-spektra tas från vattenhaltiga prover, som Raman-spridning från vatten är svag. Dessutom är Raman-spektroskopi enbart på detektion av bakåtspridning av monokromatiskt ljus, därför är inget prov bearbetning som krävs före mätning. Dessa attribut gör Ramannen spektroskopi ett lovande alternativ till potentialen in vivo avbildningstillämpningar. I detta avseende är konsekvent anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) en mycket intressant teknik eftersom den möjliggör snabbare och känsligare förvärv av uppgifter som grundar sig på samma vibrational signalerna som används i våra experiment. ^15,16 Andra alternativa metoder inklusive multiphoton-inducerad autofluorescens och andra harmoniska generationens avbildning har tidigare visat sig vara lämplig för övervakning av biologiska prover icke-eller minimal invasivt ^17. Men dessa avbildningsmetoder förknippas med mycket höga kostnader och är begränsade till autofluorescens-genererande molekyler. Dessutom är Raman-spektrometer lätt att kombinera med konventionella optiska mikroskop. Dessa egenskaper gör Raman-spektroskopi ett värdefullt verktyg för att studera biologiska prover i fysiologiska miljöer.

En av de nuvarande begränsningarna hos vår Ramanspektroskopi inrättat ärden relativt lilla laserfokus (250 nm full bredd halva maximum (FWHM) sidled och 700 nm FWHM axiell) som skapas av en hög numerisk apertur eftersträvade (NA = 1,2). Även en hög numerisk apertur kan täcka en god mängd av det emitterade ljuset Raman vilket gav i en hög signal-till-brusförhållande, alstrar den höga NA endast en liten samling fokus inom provet som är typiskt mycket mindre än en cell. För att jämföra Raman-spektra för olika celler, är den samling av ett representativt spektrum nödvändig, vilket är svårt att erhålla med en liten fokusområde. För att lösa detta, vi arbetar på en process för att automatisera signalen samlingen vid olika punkter i cellen (= Raman spektroskopi kartläggning), vilket resulterar i en spektral genomsnitt och ger en representativ spektrum. Dessutom kommer denna teknik ge en översikt över fördelningen av specifika Raman-band, exempelvis av proteinet fördelning inom en cell.

Biological prover är mycket komplexa och består av en heterogen blandning av biomolekyler som bidrar till den insamlade Raman-spektra. Därför är det spektrala mönstret mycket komplexa och övervakning av en enda typ av en molekyl inom ett Raman-spektrum är svårt att åstadkomma med överlappningen av olika molekyl-signaler. Dessutom kan inneboende fluorescens provet maskera värdefull information om svagare Raman signaler. Intressant, i några av våra tidigare studier identifierade vi autofluorescens i Raman spektra som den viktigaste särskiljande faktor mellan celltyper (MSC och fibroblaster) med hjälp av en lämplig analysverktyg. ¹³ Vi identifierade också att förändringar i den totala Raman signalintensiteten kan fungera som en indikator för staten av kollagen och fibrer kollagen inom ECM av aortaklaffen broschyrer. ⁹ Men när man analyserar tillståndet av elastin i dessa vävnader, har vi inte kunnat upptäcka liknande resultat. Såsom nämnts i det resultatetsektionen, var vi bara kan upptäcka förändringar i specifika Raman-band i elastas-behandlade prover jämfört med infödda kontrollerna. Vi såg inte en minskning av den totala Raman signalen i den enzymatiskt behandlade prover som förväntat. Dessa observationer resulterade i en poäng tomt som inte visar en tydlig klusterbildning sett i den tidigare studien. ⁹ Däremot var inflytandet av den enzymatiska behandlingen upptäckas inom PCA resultaten. Vi antar att dessa skillnader mellan de två ECM-proteiner, elastin och kollagen, är baserade på morfologiska skillnader och olika enzymatiska nedbrytningsprocesser: inom aortaklaffen broschyren är kollagen-rika zonen (fibrosa) ett kontinuerligt skikt som blir lossas på grund av enzymatisk behandling, varigenom elastin innehåller zonen (ventricularis) har en nätkonfiguration som visas fragmenteras efter exponering för elastas (fig. 4). Enstaka plats mätningar var därför inte lämpåt att upptäcka sådana små bristningar i elastin nätet. Här skulle en Raman kartläggning av vävnaden hjälpa till att identifiera driftstopp.

En annan utmaning i Raman-spektroskopi av biologiska prover är att minska mätning gånger. En lösning är att öka den lasereffekt, som är lämplig så länge som de biologiska proverna inte påverkas av foto-skada. Alla våra nuvarande experiment proof-of-principle studier som fokuserar på grundforskning, men det är vårt övergripande mål att genomföra Raman-spektroskopi för kliniska tillämpningar inklusive regenerativ medicin (t.ex. kvalitetskontroll av vävnadstekniska produkter), pre-transplantation transplantat övervakning och cancerdiagnostik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
elastase	Worthington Biochemical	LS006363
anti-elastin antibody	Sigma-Aldrich	HPA018111	1:75; citrate buffer
PBS	Lonza Inc.	17-512F
glass bottom dishes	Greiner Bio-One	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker Corporation