Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l'aide totale microscopie de fluorescence à réflexion
Summary
Fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie est une approche puissante pour observer des structures à proximité de la surface de la cellule au contraste élevé et une résolution temporelle. Nous montrons comment la FRBR peut être utilisée pour étudier la dynamique des protéines au niveau du cortex des parois cellulaires fermés cellules bactériennes et fongiques.
Abstract
Microscopie TIRF a émergé comme une technologie d'imagerie puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelles de molécules fluorescentes in vitro et dans des cellules vivantes 1. Le phénomène optique de réflexion interne totale se produit lorsque la lumière passe à partir d'un milieu d'indice de réfraction élevé dans un milieu à indice de réfraction faible à un angle plus grand qu'un angle caractéristique critique (plus près d'être parallèle à la limite). Bien que toute la lumière est réfléchie dans de telles conditions, une onde évanescente est créée qui se propage à travers et le long de la frontière, ce qui diminue de façon exponentielle avec la distance, et ne pénètre que les zones d'échantillonnage qui sont près de 100-200 nm de l'interface 2. En plus de fournir supérieure résolution axiale, l'excitation réduit de sortir de fluorophores de discussion crée un signal très élevé des ratios de bruit et minimise les effets néfastes de photoblanchiment 2,3. Être une technique widefield, la FRBR permet également d'image plus rapide en courant alternatifquisition que la plupart des configurations basées sur la numérisation confocale.
À première vue, la faible profondeur de pénétration de la FRBR semble être incompatible avec l'imagerie de cellules bactériennes et fongiques, qui sont souvent entourés de parois cellulaires épaisses. Au contraire, nous avons constaté que les parois cellulaires des levures et des cellules bactériennes réellement améliorer la convivialité de la FRBR et d'accroître l'éventail des structures observables 4-8. De nombreux processus cellulaires peuvent donc être directement accessible par la FRBR dans de petits micro-organismes monocellulaires, qui offrent souvent de puissantes techniques de manipulation génétique. Cela nous permet d'effectuer des expériences in vivo biochimie, où la cinétique des interactions entre protéines et les activités peuvent être évaluées directement dans les cellules vivantes.
Nous décrivons ici les différentes étapes nécessaires à l'obtention des images de grande qualité pour TIRF Saccharomyces cerevisiae ou des cellules de Bacillus subtilis. Nous signaler des problèmes divers qui peuvent affect FRBR visualisation des sondes fluorescentes dans les cellules et d'illustrer la procédure avec plusieurs exemples d'applications. Enfin, nous démontrons comment les images TIRF peut encore être améliorée en utilisant des techniques de restauration d'image.
Protocol
Discussion
Microscopie TIRF est la technique de choix aux protéines d'image périphériques. La profondeur de pénétration faible du champ évanescent minimise de sortir de la lumière mise au point, ce qui conduit à un signal de très bonne à bruit et permet l'acquisition de données à des vitesses élevées, ou d'imagerie de protéines exprimées très faiblement. La combinaison de contraste élevé et taux de rafraîchissement élevé rend microscopie TIRF un outil parfait pour l'imagerie dynamique spatio-t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la société Max Planck.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
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