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Medicine

Caracterización de los mecanismos moleculares de la doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo. Radiación solar ultravioleta (UVR) es el principal factor de riesgo para el desarrollo de cataratas. Un modelo animal de lejos catarata inducida por UVR-B fue desarrollado. En este artículo se describen los métodos para la investigación de la formación de cataratas: La exposición a los rayos UV, cuantitativos RT-PCR e inmunohistoquímica.

Abstract

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo 1. La Organización Mundial de la Salud define catarata como una opacidad del cristalino del ojo que impide la transmisión de la luz. La catarata es una enfermedad multifactorial asociada con la diabetes, el tabaquismo, la radiación ultravioleta (UVR), alcohol, radiación ionizante, los esteroides y la hipertensión. Hay una fuerte evidencia experimental 2-4 y epidemiológica 5,6 UVR que provoca catarata. Hemos desarrollado un modelo animal para UVR B catarata inducida en ambos anestesiados 7 y los animales no anestesiados 8.

La única cura para las cataratas es la cirugía, pero este tratamiento no es accesible a todos. Se ha estimado que un retraso de la aparición de cataratas durante 10 años podría reducir la necesidad de cirugía de cataratas en un 50% 9. Para retrasar la incidencia de cataratas, que es necesario para comprender los mecanismos de la formación de cataratas y encontrar estrategia eficaz de prevencióngias. Entre los mecanismos para el desarrollo de cataratas, la apoptosis desempeña un papel crucial en la iniciación de cataratas en los seres humanos y los animales 10. Nuestro enfoque ha sido recientemente apoptosis en la lente como el mecanismo para el desarrollo de cataratas 8,11,12. Se prevé que una mejor comprensión del efecto de la radiación UV en la vía de la apoptosis se proporcionan posibilidades para el descubrimiento de nuevos productos farmacéuticos para prevenir cataratas.

En este artículo se describe cómo catarata puede ser inducida experimentalmente por la exposición en vivo a los rayos UV-B. Además RT-PCR e inmunohistoquímica se presentan como herramientas para estudiar los mecanismos moleculares de la RUV-B inducida por la catarata.

Protocol

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1. La exposición a la radiación ultravioleta

  1. 15 min antes de la exposición, anestesiar una hembra Sprague-Dawley con una mezcla de 90 mg / kg Ketalar (ketamina) y 10 mg / kg Rompun (xilazina) por inyección intraperitoneal.
  2. Colocar el animal en un limitador de rata y apretar las correas hasta la inmovilización de la rata sin causar una compresión de tronco 13.
  3. Infundir Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, en ambos ojos de la rata para inducir midriasis.
  4. Colocar el animal de modo que un ojo se coloca contra un haz estrecho de radiación UV a 300 nm con un ancho de 14 nm 10 a media altura y proteger el ojo contralateral con cinta de color negro.
  5. Exponer la rata unilateralmente por debajo del umbral de dosis 1 kJ / m 2 RUV-B a 300 nm durante 15 minutos 15.

2. Disección

  1. Después de la pre-determinado intervalo de post-exposición (1, 5, 24 y HR 120), sacrificar la rata de seis semanas de edad (peso <200 g) por carbon asfixia dióxido de carbono y la dislocación de las vértebras cervicales.
  2. Ojos enucleación. A continuación, coloque la córnea del ojo hacia abajo, lado posterior hacia arriba. Entonces, perfore un agujero mínimo mediante la aplicación de una cánula de calibre 27 y empuje tangencial a la esclerótica para evitar dañar la lente que está muy cerca de la esclerótica. A continuación, utilice un par de tijeras de cirugía oftálmica para cortar circunferencialmente justo detrás del limbo hasta que la parte posterior de la esclerótica se puede quitar. A continuación, levante la lente con unas pinzas curvas romas.
  3. Eliminar los restos del cuerpo ciliar desde el ecuador del cristalino bajo un microscopio, manteniendo la lente en solución salina equilibrada de no más de 5-10 min.

3. RT-PCR cuantitativa

  1. Colocar una lente en una mezcla de 350 l tampón de lisis RA1 (NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total) y 3,5 l β-mercaptoetanol en un tubo Eppendorf de 2 ml.
  2. Mantener la lente en esta mezcla durante 30 min a temperatura ambiente.
  3. Homogeneizar la lente conuna aguja hasta sólo núcleo duro del cristalino que queda de la lente (la corteza y la cápsula de la lente se lisaron en tampón de lisis). Retire el núcleo de la mezcla.
  4. Almacenar las muestras inmediatamente a -70 ° C.
  5. Descongele las muestras y seguir el protocolo "Total purificación de ARN a partir de células cultivadas y tejidos" (NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total).
  6. Tienda de muestras de ARN a -70 ° C.
  7. Para verificar la eliminación suficiente de ADN de cada muestra, ejecutar una PCR en las condiciones siguientes (paso 1: 95 º C durante 2 min; paso 2 durante 40 ciclos: 95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 20 seg; paso 3: 72 º C durante 7 min) con cebadores específicos de ADN de p53, adelante 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'y revertir 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' y Taq ADN polimerasa (dNTPack), de acuerdo con la fabricación protocolo. El producto de PCR esperada es 243 pares de bases.
  8. Ejecutar un 1,5% electroforesis en gel de agarosa para detectar el producto de PCR específico de ADN de 243 pares de bases. Para preparar1,5% de gel de agarosa en tampón TBE tomar 3,75 g de agarosa y resolverlo en 250 ml de tampón TBE. Añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml) 500 l en 500 ml de solución de gel de agarosa al 1,5%. Calentar la mezcla en un horno de microondas y se agita para resolver la agarosa.

Ninguna de las muestras tiene que revelar cualquier producto de PCR específicas de ADN en electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.

  1. Medir la concentración de las muestras de ARN (1 l) y la relación de absorbancia de la muestra a 260 nm (RNA) y 280 nm (proteína) en un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro. Si el ARN a la proteína de la relación de absorbancia de la muestra de ARN es 2,0 o más, entonces la muestra de ARN es puro. Si la relación de absorbancia de la muestra de ARN es menor que 2,0, rehacer etapa de purificación de ARN 3,5.
  2. Tomar un volumen de muestra de RNA correspondiente a 1 mg y sintetizar cDNA siguiendo el protocolo 1 Kit st Strand cDNA de síntesis (1 kit st Strand cDNA de síntesis para la RT-PCR).
  3. Almacenar las muestras de ADNc a -20 º C(Por un período de 1 y más años, almacenan a -70 ° C).
  4. Ejecutar cuantitativa en tiempo real PCR en iCycler MyiQ único sistema de detección de color real PCR en tiempo. Carga triplicados en placas de 96 pocillos con 1 l de muestra cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, ensayo TaqMan Gene Expression para la caspasa 3, de acuerdo con las instrucciones de fabricación. Carga triplica en otra placa de 96 pocillos con 1 l de muestra cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, ensayo TaqMan Gene Expression para mayores de 18, de acuerdo con las instrucciones de fabricación (TaqMan Gene Expression Protocolo de ensayo). Diluir en serie una fracción de cDNA a partir de tres elegidas al azar y no expuestas lentes. Ejecutar diluciones en serie junto con el ADNc de las muestras en una placa de 96 pocillos.
  5. Usar el método de la curva estándar para la cuantificación de los resultados. El número de ciclos en la fluorescencia umbral se utiliza como la medida en software MyiQ. Una curva estándar que expresa el número de ciclos en el umbral como función de la concentración relativa de calibrador es consultadatablished para las diluciones en serie en cada placa. ADNc a partir de tres muestras no tratadas de lentes se utiliza para la calibración. Relacionar el número de ciclos de umbral para cada muestra a la curva estándar para obtener la concentración relativa de la muestra de ADNc medido. Finalmente, obtener el nivel de expresión de los genes diana mediante la relación de la concentración relativa de ADNc diana a los 18 años de control de cDNA internos.

4. La tinción inmunohistoquímica

  1. Fijación
    1. Diseccionar el ojo en PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4).
    2. Poner el ojo en un tubo lleno con 4% de paraformaldehído (PFA) en frío de hielo durante 20 min. Preparar PFA 4% el día antes. Almacenar a 4 ° C hasta su uso. PFA es fresco durante aproximadamente una semana.
    3. Eliminar PFA con una micropipeta. A continuación, lavar con PBS enfriado en hielo durante 20 min.
    4. Poner el ojo en sacarosa 30% a +4 º C durante la noche.
    5. Poner el ojo en una copa llena con la temperatura óptima de corte (OCT)-medio (Tissue-Tek). Poner el ojo en una posición adecuada para el corte.
    6. Congelar en octubre mediano con hielo seco.
    7. Almacenar a -70 ° C hasta su uso.
  2. Seccionamiento
    1. Coloque el ojo para la crio-corte en un plano adecuado.
    2. Cortar tres 5 m de espesor medio sagital secciones desde una parte central de cada lente. Descartar al menos 6 secciones entre las secciones secuenciales para evitar manchar los mismos núcleos en diferentes secciones.
    3. Una vez que una sección ha sido cortada, coloque suavemente una diapositiva en la parte superior de la misma. La sección a continuación, debe apegarse a la diapositiva.
    4. Agregar los portaobjetos se seque al aire antes de su uso. Diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su utilización.
  3. Fluorescencia inmunohistoquímica
    1. Deje que las muestras de alcanzar la temperatura ambiente (5-10 min).
    2. Dibujar bordes alrededor de las muestras con un PAP-pen (Invitrogen).
    3. Deje que la frontera seca durante un tiempo (10 min).
    4. Etiquetar los portaobjetos de microscopio.
    5. Rehidratar en 1 × PBS durante 15 min.
    6. Permeabilizar en solución estándar de bloque durante 30 min.
    7. Añadir anticuerpo primario (policlonal de conejo caspasa-3, troceados anticuerpo Asp175 9661; Tecnología de Señalización Celular, Inc), diluido 1:3000 en solución de bloqueo estándar.
    8. Almacenar en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche.
    9. Lavar en PBS por pipeteado (3 x 5 min) o por inmersión en un baño de gran tamaño (> 15 min, 1-2 cambios).
    10. Añadir anticuerpo secundario (anticuerpo de conejo anti secundaria con una específica de absorción / emisión del espectro) diluido 1:300 en la solución estándar de bloque.
    11. Lavar en PBS por pipeteado (3 x 5 min) o por inmersión en un baño de gran tamaño (> 15 min, 1-2 cambios).
    12. Limpie el pen-PAP frotis.
    13. Almacenar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 h. Evite la exposición a la luz.
    14. Añadir una gota de Vectashield y colocar un cubreobjetos sobre el portaobjetos. Evite hacer burbujas.
    15. Dejar cuajar Vectashield (~ 20 min).
    16. Mantenga apartados in la oscuridad hasta su análisis.
    17. Todas las secciones de control se procesan en ausencia de anticuerpo primario.
    18. Busque los resultados dentro de unas pocas horas bajo un microscopio de fluorescencia.
    19. Contar núcleos de células epiteliales desde un lado del arco nuclear a proa del otro lado nuclear de cada lente. Aplicar el filtro azul estándar para ver todos los núcleos epiteliales de la lente en azul y un filtro estándar que se ajuste a la emisión del anticuerpo secundario para ver los núcleos positivos caspasa-3 en verde.
    20. Registrar el número de todos los núcleos epiteliales de la lente y el número de núcleos positivos. Contar las células tres veces para cada sección.

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Representative Results

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Las diversas fuentes de variación en las mediciones se calcula con un análisis de varianza y se encontró que la consideración de tres mediciones por animal de la varianza para mediciones fue del orden de 15% del de los animales. Así, considerando el análisis de toda la lente, no es posible aumentar la precisión. Pruebas ortogonal dilucidado un contraste estadísticamente significativo para la caspasa-3 mensajes entre 120 intervalo de latencia de horas frente a cortos intervalos de latencia.

In vivo la exposición UVR induce la expresión de la caspasa-3.

Figura 1
Figura 1. Esquemática del flujo de la exposición a la radiación ultravioleta.

Figura 2
Figura 2. Evolución de la caspasa-3 (casp3) la expresión de ARNm en la lente del cristalino después de la exposición in vivo a 1 kJ / m 2 UVR a 300 nm. Las barras de error son el 95% intervalos de confianza para la proporción media de casp3 mRNA/18s rRNA entre la lente y el lente expuesto contralateral no expuestos. Los medios, por encima y por debajo de la línea de negro en un rel. unidad representan, respectivamente, de arriba a abajo-regulación del gen casp3.

Figura 3
Figura 3. Caspasa-3 de expresión (A) en una lente expuesto, 24 hr después de la exposición y (B) en una lente no expuesta. Las flechas indican las células marcadas.

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Discussion

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En este trabajo se describen los métodos que permiten estudiar los eventos moleculares que ocurren durante la RUV-B inducida por la catarata.

Teniendo en cuenta, que la mayoría de la información disponible para UVR in vivo inducida por catarata se derivó de los experimentos con ratas albinas Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, se decidió utilizar la albinas Sprague-Dawley en el estudio actual. Edad de las ratas fue de seis semanas de edad. El género fue escogido para ser mujer, ya que, a diferencia de los hombres, las mujeres tienen menos alergénico orina. Además, no hay ninguna diferencia en el género en relación con la gravedad de la catarata inducida UVR 20.

Todos los animales fueron mantenidos y tratados de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en investigación oftalmológica y Visión. Permiso ética se obtuvo de la Uppsala Experimentos con Animales Comité de Ética, número de protocolo C 29/10. Las ratas se obtuvieron de un criador comercial (Taconic, Dinamarca).

tienda "> Una fuente de UVR de banda estrecha se eligió para que la radiación UV para ser espectralmente bien definido. sensibilidad máxima de la lente de rata a los rayos UV-B es de alrededor de 300 nm. La dosis de 1 kJ / m 2 fue elegida para ser inferior a la dosis umbral 15. El tiempo de exposición de 15 min fue seleccionada para inducir el máximo daño a la lente 21. La dosis de exposición a los rayos UV-B y la hora posterior a la exposición pueden variar en función del diseño experimental.

Junto ojo órgano tiene su ventaja en términos de estadísticas y la ética en el uso de animales en la investigación. Exposición unilateral del ojo permite utilizar un lado como expuestos y otro lado como control en un animal por lo que reduce el número de animales por medio comparación con el órgano no apareado.

En este protocolo, se utiliza anestesia como un método para la inmovilización de los animales. Sin embargo, otra alternativa, rata inmovilización 13, que se ha diseñado en nuestro laboratorio, se puede usar para la inmovilización de los animales no anestesiados. Rats tiene que estar condicionada a la inmovilización rata antes de la exposición UV. Este dispositivo permite también controlar las exposiciones repetidas cuando la anestesia no se recomienda debido a sus efectos secundarios. Aquí, hemos utilizado el limitador de rata como un posicionamiento y un dispositivo de sujeción para animales anestesiados.

El limitador de rata es de madera y está disponible en varios elementos en nuestro laboratorio. Nosotros limpiamos nuestro dispositivo de retención antes de cada animal se coloca en ella. Bloques de madera, canalones y refugios de madera se utilizan como enriquecimiento en las jaulas de rata. Este enriquecimiento es aprobado por Uppsala Experimentos con Animales Comité de Ética y de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA).

La lente debe ser diseccionado en BSS en el corto período de tiempo (min 5-10). Esta restricción permite que la lente permanecen claras y transparentes.

QRT-PCR

El tiempo de 30 min para mantener la lente en el tampón de lisis RA1 es enough para interrumpir la cápsula de la lente y la corteza. El núcleo de la lente se mantiene dura dentro de 30 min. El núcleo de la lente, o una zona libre de orgánulo se considera que es una transcripción no activo parte de la lente. Por lo tanto, se extrae el núcleo de la muestra con el fin de aumentar la relación de ARNm de señal / ruido de expresión.

El cebador de ADN específico utilizado para la pureza del RNA (ausencia de ADN) de control se eligió arbitrariamente para ser p53-cebador. Todas las secuencias que ocurren generalmente codificadas de ADN de genoma animal particular podría ser elegido. Tanto las lentes fueron analizadas con PCR para 10 animales por cada intervalo de post-exposición y para cada lente, caspasa-3 se determinó el contenido de ARN en tres medidas independientes.

RT-PCR permite medir el ARNm de interés. La transcriptasa inversa convierte ARNm en ADN complementario que es entonces amplificada por PCR. Las mediciones se cuantificaron utilizando la curva estándar obtenida mediante la amplificación de las muestras diluidas en serie de cDNA de la interest. Las ventajas de la aplicación de una curva estándar son que la curva estándar proporciona un método fiable para calcular la incertidumbre de la concentración, y que la curva estándar proporciona las mediciones cuantitativas de la ARNm de interés. Alternativamente, el contenido relativo del ARNm de interés podría ser estimado comparando directamente el número de ciclos necesarios para obtener una señal de fluorescencia normalizada, la CT-método. El principal inconveniente de la curva de calibración es que requiere el uso de más productos genómicos que el método de Ct.

La tinción inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se utilizó para estudiar la distribución espacial de la caspasa-3 en células epiteliales de la lente.

Los ojos fueron inmediatamente congeladas a -70 ° C para detener toda la bioquímica en curso. Los ojos fueron almacenados a la misma temperatura para su conservación.

La inmunohistoquímica se asocia con dos general de problemas y la especificidad del anticuerpo primario y la unión no específica del anticuerpo. El anticuerpo se debe adquirir de una fuente bien controlada, garantizando así la especificidad. Si es posible, el tejido que contiene el epítopo debe ser coloreada como un control positivo. Con el fin de outrule la tinción no específica, si es posible, el epítopo se debe bloquear antes de la tinción con el anticuerpo específico de control, negativo. Tinción Además, no específica se puede minimizar mediante el establecimiento de la concentración óptima de anticuerpos y tiempo de reacción. Por tinción tanto en el tejido expuesto a los rayos UV y el tejido no expuesto a los rayos UV, es posible establecer la UVR epítopo inducida, aquí la caspasa-3. Para facilitar el conteo de las células que expresan caspapse-3 señal de la imagen del microscopio de fluorescencia se registraron digitalmente. Con el fin de minimizar la variación de ruido de fondo, se utilizó un ajuste fijo para todas las fotografías de microscopio.

La intensidad de la señal de fluorescencia de fondo varía en un coescala continua que. Por lo tanto, un umbral para la tinción significativa tiene que ser establecido. Sin embargo, la media de fluorescencia puede variar espacialmente dentro de la sección observó lo que hace difícil utilizar un umbral absoluto para la tinción significativa. Por lo tanto, normalmente el juicio de la tinción específica se basa en un observador experimentado y el resultado favorable de la tinción específica depende de la opinión del observador con experiencia, pero será constante para ese observador. Por esta razón, sólo un observador experimentado fue utilizado. Para mejorar la señal causada por la variable experimental exposición, a los rayos UV, en comparación con el ruido, la fotografía de cada sección se contó tres veces.

Si es posible, la inmunohistoquímica debe ser verificada mediante western blot lo que confirma la existencia de epítopos con el tamaño molecular esperado.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Karolinska KID-financiación, la Autoridad Sueca de Protección Radiológica, Instituto Karolinska Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Eye St. Erik el Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

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References

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Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

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