Karakterisering van moleculaire mechanismen van<em> In vivo</em> UVR Induced Cataract
Summary
Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld. UV-zonnestralen (UVR) is de belangrijkste risicofactor voor de ontwikkeling van cataract. Een diermodel van ver UVR-B geïnduceerde cataract ontwikkeld. In dit artikel beschrijven we methoden voor onderzoek naar cataract: blootstelling aan UVR, kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie.
Abstract
Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld 1. De World Health Organization definieert cataract als een vertroebeling van de lens van het oog die de overdracht van licht belemmert. Cataract is een multifactoriële aandoening is in verband met diabetes, roken, ultraviolette straling (UVR), alcohol, ioniserende straling, steroïden en hoge bloeddruk. Er is een sterke experimentele 2-4 en epidemiologische bewijzen dat 5,6 UVR cataract veroorzaakt. Wij een diermodel voor UVR B geïnduceerde cataract in zowel verdoofd 7 en niet-verdoofde dieren 8.
De enige remedie voor cataract is een operatie, maar deze behandeling is niet voor iedereen toegankelijk. Er is geschat dat een vertraging van het begin van cataract 10 jaar zou de noodzaak voor cataractchirurgie met 50% 9. Om de incidentie van cataract vertragen, is het nodig om de mechanismen van cataract te begrijpen en vinden effectieve preventie strategies. Onder de mechanismen voor cataract ontwikkeling apoptose speelt een cruciale rol bij de initiatie van cataract bij mensen en dieren 10. Onze focus is onlangs apoptose in de lens als het mechanisme voor de ontwikkeling van cataract 8,11,12. Verwacht wordt dat een beter begrip van het effect van UVR op de apoptose route zal mogelijkheden bieden voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen te voorkomen cataract.
In dit artikel beschrijven we hoe cataract kan experimenteel geïnduceerd worden door in vivo blootstelling aan UVR-B. Verdere RT-PCR en immunohistochemie worden gepresenteerd als hulpmiddel om de moleculaire mechanismen van UVR-geïnduceerde cataract B bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de methoden die het mogelijk maken het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens UVR-B geïnduceerde cataract.
Aangezien dat de meeste informatie in vivo UVR geïnduceerde cataract werd verkregen uit proeven op albino Sprague-Dawley ratten 7, 16, 17, 18, 19, besloten we de albino Sprague-Dawley rat gebruikt in de huidige studie. Leeftijd van de ratten was zes weken oud. Het geslacht werd gekozen tot vrouwelijke, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Karolinska Institutet KID-financiering, Zweeds Instituut voor Stralingsbescherming, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Erik's Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 |
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR – B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. . Cataract from ultraviolet radiation. , (2001).
- Ayala, M. N. . Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , (2005).
- Dong, X. . Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
