Karakterisering av molekylära mekanismer<em> In vivo</em> UVR inducerad Cataract
Summary
Katarakt är den vanligaste orsaken till blindhet i världen. Ultraviolett solstrålning (UVR) är den viktigaste riskfaktorn för grå starr utveckling. En djurmodell för långt UVR-B-inducerad katarakt utvecklades. I den här artikeln beskriver vi metoder för undersökning av grå starr: exponering för UVR, kvantitativ RT-PCR och immunohistokemi.
Abstract
Katarakt är den vanligaste orsaken till blindhet i världen 1. Världshälsoorganisationen definierar katarakt som en grumling av linsen i ögat som hindrar överföring av ljus. Katarakt är en multifaktoriell sjukdom associerad med diabetes, rökning, ultraviolett strålning (UVR), alkohol, joniserande strålning, steroider och hypertoni. Det finns en stark experimentell 2-4 och epidemiologiska bevis 5,6 att UVR orsakar katarakt. Vi utvecklade en djurmodell för UVR B inducerad katarakt i både sövda 7 och icke-sövda djur 8.
Den enda botemedel mot grå starr är operation, men denna behandling är inte tillgänglig för alla. Man har uppskattat att en fördröjning av början av katarakt under 10 år kan minska behovet av kataraktkirurgi med 50% 9. Att fördröja förekomsten av katarakt, är det nödvändigt att förstå mekanismerna för kataraktbildning och hitta effektiva förebyggande strategier. Bland mekanismerna för katarakt utveckling spelar apoptos en avgörande roll i initiering av katarakt hos människor och djur 10. Vårt fokus har nyligen apoptos i linsen som mekanismen för katarakt utveckling 8,11,12. Det förväntas att en bättre förståelse av effekten av UVR på apoptos vägen kommer att ge möjligheter för upptäckt av nya läkemedel för att förhindra grå starr.
I den här artikeln beskriver vi hur katarakt experimentellt kan induceras genom in vivo-exponering UVR-B. Ytterligare RT-PCR och immunohistokemi presenteras som verktyg för att studera molekylära mekanismer UVR-B-inducerad katarakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver metoder som möjliggör studier molekylära händelser som inträffar under UVR-B inducerade katarakt.
Med tanke på att de flesta angiven för in vivo-UVR inducerad katarakt härrör från försök på albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, bestämde vi oss för att använda albino Sprague-Dawley råtta i den aktuella studien. Ålder råttorna var sex veckor gammal. Kön valdes till kvinnlig eftersom, i motsats till män, kvinnor ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Karolinska Institutets KID-medel, svenska strålskyddsinstitut, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun OCH Bertil Stohnes Stiftelse, St Eriks Ögonsjukhus Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s OCH Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 |
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR – B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. . Cataract from ultraviolet radiation. , (2001).
- Ayala, M. N. . Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , (2005).
- Dong, X. . Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
