Summary

Karakterisering av molekylære mekanismer for<em> In vivo</em> UVR Induced Cataract

Published: November 28, 2012
doi:

Summary

Katarakt er den ledende årsak til blindhet i verden. Solar ultrafiolett stråling (UVR) er den viktigste risikofaktor for katarakt utvikling. En dyremodell for mye til UVR-B indusert katarakt ble utviklet. I denne artikkelen beskriver vi metoder for etterforskning av katarakt: eksponering for UVR, kvantitativ RT-PCR og immunhistokjemi.

Abstract

Katarakt er den ledende årsak til blindhet i verden en. The World Health Organization definerer katarakt som en uklarhet i linsen i øyet som hindrer overføring av lys. Grå stær er en multi-faktoriell sykdom forbundet med diabetes, røyking, ultrafiolett stråling (UVR), alkohol, ioniserende stråling, steroider og hypertensjon. Det er sterk eksperimentell 2-4 og epidemiologiske bevis 5,6 som UVR forårsaker grå stær. Vi utviklet en dyremodell for UVR B indusert katarakt både bedøvet 7 og ikke-bedøvede dyr 8.

Den eneste kur for katarakt er operasjon, men denne behandlingen er ikke tilgjengelig for alle. Det har blitt anslått at en forsinkelse på utbruddet av katarakt i 10 år kunne redusere behovet for kataraktoperasjon med 50% 9. Å forsinke forekomsten av katarakt, er det nødvendig å forstå mekanismene for katarakt og finne effektive forebyggende strategiegies. Blant mekanismer for katarakt utvikling, spiller apoptose en avgjørende rolle i initiering av katarakt hos mennesker og dyr 10. Vårt fokus har nylig vært apoptose i linsen som mekanisme for katarakt utvikling 8,11,12. Det er forventet at en bedre forståelse av virkningen av UVR på apoptose veien vil gi muligheter for oppdagelsen av nye legemidler for å forhindre katarakt.

I denne artikkelen beskriver vi hvordan katarakt kan eksperimentelt indusert ved in vivo eksponering for UVR-B. Videre RT-PCR og immunhistokjemi presenteres som verktøy for å studere molekylære mekanismer for UVR-B indusert katarakt.

Protocol

1. Eksponering for ultrafiolett stråling 15 min før eksponeringen anesthetize en Sprague-Dawley rotte med en blanding av 90 mg / kg Ketalar (ketamin) og 10 mg / kg Rompun (xylazin) ved intraperitoneal injeksjon. Plasser dyret i en rotte restrainer og stram beltet før immobilisering av rotte uten å forårsake en koffert klemme 13. Innpode Mydriacyl (Tropicamide), 10 mg / ml, i begge øyne hos rotte for å indusere mydriasis. Plasser dyret slik at det ene øyet er pl…

Representative Results

De forskjellige kilder til variasjon i målingene ble beregnet med en analyse av varians og det ble funnet at vurderer tre målinger pr dyr variansen for målinger var av størrelsesorden 15% av det for dyr. Således, tatt i betraktning hel linse analyse, er det ikke mulig å øke presisjonen. Ortogonale testing belyst en statistisk signifikant kontrast for caspase-3-melding mellom 120 hr latency intervall versus kortere ventetid intervaller. In vivo UVR eksponering induserer caspas…

Discussion

Dette notatet beskriver metoder som gjør det mulig å studere molekylære hendelser oppstår under UVR-B indusert katarakt.

Betraktning, at de fleste informasjon tilgjengelig for in vivo UVR indusert katarakt ble avledet fra eksperimenter på albino Sprague-Dawley rotter 7, 16, 17, 18, ​​19, bestemte vi å bruke albino Sprague-Dawley rotte i studien. Alder av rottene var seks uker gammel. Kjønnet ble valgt til å være kvinnelige fordi, i motsetning til menn, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Karolinska Institutet KID-midler, svensk strålevern, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Erik Øye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

References

  1. Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
  2. Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
  3. Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
  4. Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR – B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
  5. McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
  6. Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
  7. Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, 1-77 (1990).
  8. Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
  9. McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
  10. Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
  11. Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
  12. Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
  13. Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
  14. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
  15. Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
  16. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
  17. Löfgren, S. . Cataract from ultraviolet radiation. , (2001).
  18. Ayala, M. N. . Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , (2005).
  19. Dong, X. . Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , (2005).
  20. Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
  21. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).

Play Video

Cite This Article
Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

View Video