Karakterisering av molekylære mekanismer for<em> In vivo</em> UVR Induced Cataract
Summary
Katarakt er den ledende årsak til blindhet i verden. Solar ultrafiolett stråling (UVR) er den viktigste risikofaktor for katarakt utvikling. En dyremodell for mye til UVR-B indusert katarakt ble utviklet. I denne artikkelen beskriver vi metoder for etterforskning av katarakt: eksponering for UVR, kvantitativ RT-PCR og immunhistokjemi.
Abstract
Katarakt er den ledende årsak til blindhet i verden en. The World Health Organization definerer katarakt som en uklarhet i linsen i øyet som hindrer overføring av lys. Grå stær er en multi-faktoriell sykdom forbundet med diabetes, røyking, ultrafiolett stråling (UVR), alkohol, ioniserende stråling, steroider og hypertensjon. Det er sterk eksperimentell 2-4 og epidemiologiske bevis 5,6 som UVR forårsaker grå stær. Vi utviklet en dyremodell for UVR B indusert katarakt både bedøvet 7 og ikke-bedøvede dyr 8.
Den eneste kur for katarakt er operasjon, men denne behandlingen er ikke tilgjengelig for alle. Det har blitt anslått at en forsinkelse på utbruddet av katarakt i 10 år kunne redusere behovet for kataraktoperasjon med 50% 9. Å forsinke forekomsten av katarakt, er det nødvendig å forstå mekanismene for katarakt og finne effektive forebyggende strategiegies. Blant mekanismer for katarakt utvikling, spiller apoptose en avgjørende rolle i initiering av katarakt hos mennesker og dyr 10. Vårt fokus har nylig vært apoptose i linsen som mekanisme for katarakt utvikling 8,11,12. Det er forventet at en bedre forståelse av virkningen av UVR på apoptose veien vil gi muligheter for oppdagelsen av nye legemidler for å forhindre katarakt.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan katarakt kan eksperimentelt indusert ved in vivo eksponering for UVR-B. Videre RT-PCR og immunhistokjemi presenteres som verktøy for å studere molekylære mekanismer for UVR-B indusert katarakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette notatet beskriver metoder som gjør det mulig å studere molekylære hendelser oppstår under UVR-B indusert katarakt.
Betraktning, at de fleste informasjon tilgjengelig for in vivo UVR indusert katarakt ble avledet fra eksperimenter på albino Sprague-Dawley rotter 7, 16, 17, 18, 19, bestemte vi å bruke albino Sprague-Dawley rotte i studien. Alder av rottene var seks uker gammel. Kjønnet ble valgt til å være kvinnelige fordi, i motsetning til menn, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Karolinska Institutet KID-midler, svensk strålevern, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Erik Øye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 |
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR – B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. . Cataract from ultraviolet radiation. , (2001).
- Ayala, M. N. . Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , (2005).
- Dong, X. . Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
