Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

אפיון מנגנונים מולקולריים של doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

קטרקט הוא הסיבה המובילה לעיוורון בעולם. קרינת אולטרה סגולה שמש (UVR) הוא גורם הסיכון העיקרי להתפתחות קטרקט. מודל חיה של הרבה UVR-B המושרה קטרקט פותח. במאמר זה אנו מתארים שיטות לחקירה של היווצרות קטרקט: חשיפה לUVR, כמותית RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה.

Abstract

קטרקט הוא הסיבה המובילה לעיוורון בעולם 1. ארגון הבריאות העולמית מגדיר את הקטרקט כערפול של עדשת העין שמעכבת את ההעברה של אור. קטרקט הוא מחלה רבה עצרת קשורה עם סוכרת עישון קרינה, אולטרה סגול (UVR), אלכוהול, קרינה מייננת, סטרואידים ויתר לחץ דם. יש ראיות 2-4 ניסיוניות ואפידמיולוגי חזקות 5,6 שUVR גורם קטרקט. פתחנו מודל חיה לUVR B מושרה קטרקט בשני 7 מורדמים וחיות שאינן מורדמות 8.

התרופה היחידה לקטרקט היא ניתוח, אבל הטיפול הזה אינו נגיש לכל. ההערכה הוא, כי עיכוב של הופעת הקטרקט במשך 10 שנים יכול להפחית את הצורך בניתוח קטרקט על ידי 50% 9. כדי לעכב את השכיחות של קטרקט, הוא נחוץ כדי להבין את המנגנונים של היווצרות קטרקט ולמצוא strat מניעה היעילהegies. בין המנגנונים להתפתחות קטרקט, אפופטוזיס ממלא תפקיד מכריע בייזום של קטרקט בבני אדם ובעלי החיים 10. ההתמקדות שלנו הייתה לאחרונה אפופטוזיס בעדשה כמנגנון לקטרקט פיתוח 8,11,12. זה צפוי כי הבנה טובה יותר של ההשפעה של UVR על מסלול אפופטוזיס תספק אפשרויות לגילוי של תרופות חדשות למניעת קטרקט.

במאמר זה, אנו מתארים כיצד קטרקט יכול להיגרם על ידי ניסוי בחשיפת vivo לUVR-B. בהמשך RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה מוצגים ככלים ללמוד מנגנונים מולקולריים של UVR-B המושרה קטרקט.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. חשיפה לקרינת אולטרה סגולה

  1. 15 דקות לפני החשיפה, להרדים חולדת נקבת ספראג-Dawley בתערובת של 90 מ"ג / קילו Ketalar (קטמין) ומ"ג / הק"ג Rompun 10 (xylazine) על ידי הזרקת intraperitoneal.
  2. הנח את החיה בעוצרת חולדה ולהדק את החגורות עד קיבוע של העכברוש מבלי לגרום לסחוט גזע 13.
  3. להנחיל Mydriacyl (tropicamide), 10 מ"ג / מ"ל, בשתי עיניה של חיה כדי לגרום mydriasis.
  4. הנח את החיה, כך שעין אחת ממוקמת על קורה צר של UVR ב 300 ננומטר 14 עם רוחב 10 ננומטר בחצים המרביים ולגונן על העין הנגדית בסרטים שחורים.
  5. לחשוף את החולדה באופן חד צדדי לסף תת מינון 1 kJ / מ 2 UVR-B ב 300 ננומטר ל15 15 דקות.

2. בתור

  1. לאחר הפסקת חשיפת הודעה שנקבעה מראש (1, 5, 24 ו 120 שעות), להקריב את העכברוש הזקן של שישה שבועות (משקל <200 ג') על ידי carboחנק n דו ופריקה של חוליות הצוואר.
  2. עיני Enucleate. לאחר מכן, הכניס את קרנית העין למטה, בצד אחורי למעלה. ואז, אגרוף חור מינימאלי על ידי יישום צינורית מד 27 ולדחוף את נקודת השקה אחת ללובן העין כדי למנוע ניזק לעדשה שהיא מאוד קרוב ללובן העין. לאחר מכן, השתמש במספרי ניתוחים לרפואת עיניים לחתוך circumferentially ממש מאחורי גובל עד החלק האחורי של לובן העין יכול להיות המריא. לאחר מכן, הרם את העדשה עם מלקחיים מעוקלים בוטים.
  3. הסר שאריות של גוף ריסי מקו משווית העדשה תחת מיקרוסקופ, שמירה על העדשה בתמיסת מלח מאוזנת לא יותר מדקות 5-10.

3. כמותית RT-PCR

  1. הנח עדשות בתערובת של חיץ 350 μl RA1 תמוגה (NucleoSpin רנ"א השני סך רנ"א בידוד ערכה) וβ-mercaptoethanol μl 3.5 בצינור 2 מ"ל אפנדורף.
  2. לשמור את העדשה בתמהיל זה במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. הומוגני העדשה עםמחט עד גרעין קשה בלבד של העדשה לא מהעדשה (קורטקס והקפסולה של העדשה lysed במאגר תמוגה). הסר את הגרעין מהתערובת.
  4. דגימות חנות באופן מיידי ב -70 ° C.
  5. הפשר את הדגימות ובצעו את הפרוטוקול "טיהור סה"כ RNA מן התאים ורקמות בתרבית" (NucleoSpin רנ"א השני סך רנ"א בידוד ערכה).
  6. דגימות RNA חנות ב -70 ° C.
  7. כדי לוודא הסרה מספקת של דנ"א מכל מדגם, לרוץ PCR בתנאים הבאים (שלב 1: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב 2 במשך 40 מחזורים: 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 ° צלזיוס במשך 20 שניות; שלב 3: 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות) עם פריימרים ספציפיים DNA p53, קדימה 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'ו5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3 הפוכים "וDNA פולימראז תקי (dNTPack), בהתאם לייצור פרוטוקול. מוצר ה-PCR הצפוי הוא 243 זוגות בסיסים.
  8. הפעל 1.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose לזהות מוצר ספציפי PCR DNA של 243 זוגות בסיסים. כדי להכין1.5% agarose ג'ל בTBE חיץ לקחת 3.75 גרם של agarose ולפתור אותה ב250 מ"ל של חיץ TBE. הוסף ethidium ברומיד (0.5 מ"ג / מ"ל) 500 μl ב500 מ"ל של 1.5% פתרון ג'ל agarose. מחמם את התערובת במיקרוגל ומערבב אוון לפתור agarose.

אף אחת מהדגימות יש לחשוף את כל מוצרי ה-PCR DNA ספציפיים על 1.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose.

  1. למדוד את הריכוז של דגימות RNA (μl 1) והיחס של ספיגת מדגם ב 260 ננומטר (RNA) ו 280 ננומטר (חלבון) בספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000. אם היחס רנ"א לחלבון של ספיגת מדגם RNA הוא 2.0 או יותר ואז מדגם RNA הוא טהור. אם היחס של ספיגת מדגם RNA הוא נמוך יותר מאשר 2.0, לעשות שוב RNA צעד טיהור 3.5.
  2. קח נפח של מדגם RNA מקביל למיקרוגרם 1 ולסנתז cDNA בעקבות ערכת פרוטוקול 1 st סטרנד cDNA הסינתזה (ערכת 1 st סטרנד cDNA סינתזה לRT-PCR).
  3. לאחסן דגימות cDNA ב -20 ° C(לתקופה של 1 שנה ויותר, בחנות ב -70 ° C).
  4. הפעל PCR כמותית בזמן אמת במערכת iCycler MyiQ יחידה צבע בזמן אמת PCR לזיהוי. עומס triplicates על צלחת 96 היטב עם מדגם 1 μl cDNA, TaqMan ביטוי גני מאסטר מיקס, Assay ביטוי גני TaqMan ל3 caspase, על פי הוראות לייצור. עומס triplicates על צלחת 96 היטב אחרת עם מדגם 1 μl cDNA, TaqMan ביטוי גני מאסטר מיקס, Assay ביטוי גני TaqMan ל18s, על פי הוראות לייצור (פרוטוקול Assay ביטוי גני TaqMan). לדלל בסדרת שבריר של cDNA משלוש עדשות שאינן חשופות נבחרו באקראי. הפעל דילולים סידוריים יחד עם cDNA מדגימות בצלחת 96 היטב.
  5. השתמש בשיטת עקומת הסטנדרט לכימות של התוצאות. מספר המחזורים בפלואורסצנטי הסף משמש כמדידה בתוכנת MyiQ. עקומת סטנדרט מבטא מספר המחזורים בסף כפונקציה של ריכוז יחסי של כיל היא established לדילולים הסידוריים בכל צלחת. cDNA משלוש דגימות עדשה טופלו אינן שמש לכיול. מתייחס למספר הסף של מחזורים לכל דגימה לעקומה הסטנדרטית כדי להשיג את הריכוז היחסי של מדגם cDNA נמדד. לבסוף, לקבל את רמת ביטוי של גני המטרה בהבאת הריכוז היחסי של יעד cDNA ל18s הבקרה הפנימי cDNA.

4. Immunohistochemical המכתים

  1. קבעון
    1. לנתח את העין ב PBS (Buffered Saline פוספט; pH 7.4).
    2. שים עין בצינור מלא paraformaldehyde 4% (PFA) בקור קרח במשך 20 דקות. הכן 4% PFA היום קודם לכן. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. PFA הוא טרי במשך כשבוע.
    3. הסר PFA עם micropipette. לאחר מכן, לשטוף עם הקרח הקר PBS במשך 20 דקות.
    4. שים עין ב30% סוכרוז ב4 ° C במשך הלילה.
    5. שים עין בכוס מלאה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר)-בינונית (רקמות-Tek). שים עין בעמדה מתאימה לחתך.
    6. הקפא באוקטובר בינוני על קרח יבש.
    7. חנות ב -70 ° C עד שימוש.
  2. קטגוריות קיימות
    1. מקם את עין cryo-החתך במטוס מתאים.
    2. אותו שלושה סעיפים 5 אמצע sagittal עבים מיקרומטר מחלק מרכזי של כל עדשה. השלך לפחות 6 חלקים בין חלקים רציפים, כדי למנוע הכתמה אותו הגרעינים בסעיפים שונים.
    3. ברגע שסעיף נחתך, מניחים בעדינות שקופיות על גבי זה. הסעיף צריך אז לתקוע לשקופית.
    4. השאר את השקופיות לייבוש באוויר לפני השימוש. שקופיות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד הצורך.
  3. פלואורסצנטי אימונוהיסטוכימיה
    1. בואו דגימות להשיג טמפרטורת חדר (5-10 דקות).
    2. צייר קצוות סביב דגימות עם PAP-עט (Invitrogen).
    3. בואו הגבול יבש לזמן (10 דקות).
    4. תייג את שקופיות מיקרוסקופ.
    5. Rehydrate ב1 × PBS במשך 15 דקות.
    6. Permeabilize בפתרון בלוק סטנדרטי למשך 30 דקות.
    7. הוסף נוגדן ראשוני (הארנב caspase-3 polyclonal, בקע נוגדן Asp175 9661; טכנולוגית איתות תא, Inc) דילול 1:3,000 בפתרון בלוק סטנדרטי.
    8. חנות בתא humidified ב4 ° C במשך הלילה.
    9. שטוף ב PBS על ידי pipetting (3 × 5 דקות) או על ידי טבילה באמבטיה גדולה (> 15 דקות, 1-2 שינויים).
    10. הוסף נוגדן שניוני (נוגדן אנטי משני ארנב עם ספקטרום ספציפי קליטה / פליטה) דילול 1:300 בפתרון הבלוק הסטנדרטי.
    11. שטוף ב PBS על ידי pipetting (3 × 5 דקות) או על ידי טבילה באמבטיה גדולה (> 15 דקות, 1-2 שינויים).
    12. נגב את משטח פאפ-עט.
    13. אחסן בתא humidified בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות. הימנע מחשיפה לאור.
    14. הוסף טיפת Vectashield ולמקם את תלוש כיסוי בשקופית. הימנע עושה בועות.
    15. בואו Vectashield להקשיח (~ 20 דקות).
    16. שמור לי קטעיםn החושך עד ניתוח.
    17. כל סעיפי הבקרה מעובדים בהעדר הנוגדן ראשוני.
    18. חפש את התוצאות בתוך כמה שעות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    19. ספירת גרעיני תאי אפיתל 'מקידה גרעינית צד אחד לקשת גרעינית הצד השנייה של כל עדשה. להחיל את המסנן הכחול הסטנדרטי כדי לראות את כל גרעיני עדשת אפיתל בכחול ומסנן סטנדרטי שמתאים לפליטה של ​​הנוגדן המשני כדי לראות גרעינים החיוביים caspase-3 בירוק.
    20. רשום את המספר של כל גרעיני אפיתל העדשה ומספר הגרעינים חיוביים. ספירת התאים שלוש פעמים לכל מקטע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המקורות השונים של שונות במדידות נאמדו בניתוח שונה ונמצא כי שוקל שלוש מדידות לבעלי חיים שונים למדידות הייתה על הסדר של 15% כי לבעלי חיים. לפיכך, בהתחשב בניתוח עדשה כולה, לא ניתן להגדיל את הדיוק. בדיקות אורתוגונלית הובהרו ניגוד מובהק ל- 3 caspase מסר בין מרווח 120 שעתי השהיה לעומת מרווחי השהיה קצרות יותר.

בחשיפת UVR vivo גורם ביטוי caspase-3.

איור 1
איור 1. סכמטי של הזרימה של חשיפה לקרינת אולטרה סגולה.

איור 2
איור 2. אבולוציה של caspase-3 (casp3) ביטוי mRNA בעדשת הגבישים לאחר בחשיפת vivo עד 2 UVR 1 kJ / מ 'ב 300 ננומטר. ברי שגיאה הם רווח סמך 95% עבור יחס ממוצע של casp3 mRNA/18s rRNA בין עדשה חשופה ועדשה נגדית לא נחשפה. האמצעים, מעל ומתחת לקו השחור ב1 rel. יחידה, בהתאמה, מייצגת למעלה ולמטה רגולציה של גן casp3.

איור 3
איור 3. Caspase-3 ביטוי () בעדשה חשופה, 24 שעות לאחר חשיפה ו( ב ') בעדשה שאינה חשופה. חיצים מראים תאים שכותרתו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מאמר זה מתאר שיטות המאפשרות לימוד אירועים מולקולריים המתרחשים במהלך UVR-B המושרה קטרקט.

בהתחשב, כי רוב המידע זמין לin vivo UVR המושרה קטרקט נגזר מניסויים בבקן ספראג-Dawley 7 חולדות, 16, 17, 18, ​​19, החליט להשתמש בעכבר לבקן ספראג-Dawley במחקר הנוכחי. הגיל של החולדות היה שישה שבועות ישן. המגדר נבחר להיות נשי כי, בניגוד לגברים, לנשים יש פחות שתן אלרגני. יתר על כן, אין הבדל במגדר ביחס לחומרת UVR המושרה 20 הקטרקט.

כל בעלי החיים הוחזקו וטופלו על פי הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר. אישור אתי התקבל מהניסויים בבעלי חי אופסלה ועדת האתיקה, פרוטוקול מספר 29 ג'/ 10. חולדות מתקבלות ממגדל מסחרי (הטקוניק, דנמרק).

אוהל "> מקור UVR צר נבחר על מנת UVR להיות מוגדרים היטב ספקטרלי. רגישות מרבית של עדשת החולדה לUVR-B היא סביב 300 ננומטר. המינון 1 kJ / מ 2 נבחר להיות מתחת למינון הסף 15. זמן החשיפה של 15 דקות נבחר כדי לגרום לניזק מקסימאלי לעדשות 21. המינון של חשיפה לUVR-B וזמן שלאחר חשיפה יכול להשתנות בהתאם לעיצוב ניסיוני.

עין איבר מותאם יש יתרון במונחים של סטטיסטיקה ואתיקה בשימוש בבעלי חיים במחקר. חשיפה חד צדדית של העין מאפשרת להשתמש בצד אחד כחשוף וצד אחר כשליטה בבעל חיים אחד ובכך היא מפחית מספר בעלי החיים בחצי בהשוואה לאיברים מזווגים.

בפרוטוקול זה השתמש הרדמה כשיטה לקיבוע של בעלי חיים. עם זאת, חלופה אחרת, העכברוש עוצר 13, שתכננו במעבדה שלנו, יכולה לשמש לקיבוע של חי unanaesthetized. Rats צריך להיות מותנה לעוצר עכברוש לפני החשיפה לקרינת UV. מכשיר זה מאפשר חשיפות חוזרות ונשנית בשליטה גם כאשר ההרדמה אינה מומלצת בשל תופעות הלוואי שלה. הנה, השתמש עוצרת החולדה כמיצוב והחזקת מכשיר לבעלי חיים מורדמים.

עוצר העכברוש עשוי מעץ וזמין במספר פריטים במעבדה שלנו. אנחנו מנקים המכשיר המרסן שלנו לפני כל חיה ממוקמת עליו. קוביות עץ, מרזבים ומקלטי עץ משמשים כהעשרה בכלובי העכברים. העשרה כזו היא אושרה על ידי בעלי חי אופסלה ניסויי ועדת אתיקה ופדרציה של אגודות מדע חי מעבדה אירופית (FELASA).

העדשה צריכה להיות גזורה בBSS בפרק זמן קצר (5-10 דקות). הגבלה זו מאפשרת העדשה להישאר ברורה ושקופה.

qRT-PCR

הזמן של 30 דקות לשמירה על העדשה בחיץ תמוגה RA1 הוא enough לשבש את הקפסולה העדשה וקליפת המוח. גרעין העדשה קשה נשאר בתוך 30 דקות. גרעין העדשה, או אזור אברון ללא נחשב לחלק שעתוק הלא פעיל של העדשה. לכן, הגרעין הוא להסיר את המדגם כדי להגדיל את יחס ביטוי mRNA אות / רעש.

פריימר הספציפי DNA משמש לטוהר רנ"א (היעדרות של DNA) שליטה נבחר באופן שרירותי להיות p53-פריימר. רצפים המקודדים בדרך מתרחשים של DNA של הגנום חיה מסוים יכולים להיבחר. שני העדשות נותחו עם PCR ל10 חיות למרווח שלאחר חשיפה ולכל עדשה, תוכן רנ"א caspase-3 היה נחוש בשלוש מדידות בלתי תלויות.

RT-PCR מאפשר למדוד את ה-mRNA של עניין. Transcriptase ההפוכה ממירה mRNA אל תוך הדנ"א משלים אשר לאחר מכן הוא מוגבר על ידי PCR. מדידות לכמת באמצעות עקומת הסטנדרט מתקבלת על ידי דגימות דילול סדרת הגברה של cDNA של interest. היתרונות של החלת עקומת סטנדרט הם שהעקומה הסטנדרטית מספקת דרך אמינה לחשב את אי הוודאות של הריכוז, ושהעקומה הסטנדרטית מספקת מדידות כמותיות של mRNA של עניין. לחלופין, התוכן היחסי של mRNA של עניין יכול להיות מוערך על ידי השוואת מספר המחזורים הנדרשים לקבלת אות פלואורסצנציה טופלה, בשיטת Ct ישירות. החסרון העיקרי של עקומת הכיול הוא שזה דורש שימוש במוצרים הגנומי יותר מאשר שיטת CT.

Immunohistochemical המכתים

אימונוהיסטוכימיה שמשה ללמוד פיזור המרחבי של caspase-3 פעילים בתאי אפיתל עדשה.

העיניים הוקפאו מייד ל-70 ° C להפסיק את כל הביוכימיה המתמשכת. את העיניים ואז היו מאוחסנים באותה הטמפרטורה לשימור.

אימונוהיסטוכימיה קשורה 2 כלליים פרוblems; את הספציפיות של הנוגדן הראשוני והמחייב ספציפיים שאינן של הנוגדן. הנוגדן צריך להירכש ממקור מבוקר היטב, ובכך מבטיח את הספציפיות. אם אפשר, רקמה המכילה את epitope צריכה להיות מוכתמת כביקורת חיובית. כדי outrule מכתים לא ספציפי, אם אפשר, epitope צריך להיות חסום בפני הכתמה עם הנוגדן הספציפית שליטה, שלילית. כתמים נוספים, שאינם ספציפיים ניתן למזער על ידי הקמת ריכוז נוגדנים האופטימליים וזמן התגובה. ע"י השאיר גם הרקמה החשופה לUVR ורקמות אינן חשופות לUVR, ניתן להקים UVR המושרה epitope, כאן caspase-3. כדי להקל על ספירת התאים לבטא אות caspapse-3 תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי נרשמה באופן דיגיטלי. כדי למזער את הווריאציה של רעשי רקע, השתמש בהגדרות קבועות לכל תצלומי מיקרוסקופ.

עוצמת האות לקרינת רקע משתנית על שיתוףהיקף ntinuous. לכן, סף להכתמה משמעותית צריך להיות מוגדר. עם זאת, את הקרינה הממוצעת עשויה להשתנות מרחבית בתוך הקטע נצפה ולכן קשה להשתמש בסף מוחלט להכתמה משמעותית. לכן, בדרך כלל, פסק דינו של מכתים ספציפי מסתמך על משקיף מנוסה והתוצאה המוחלטת של כתמים ספציפיים תלויה בדעתו של הצופה המנוסית אבל יהיה עקבי שלמתבונן. מסיבה זו, רק אחד משקיף מנוסה היה בשימוש. כדי לשפר את האותות הנגרמים על ידי משתנה, חשיפה הניסיונית לUVR, בהשוואה לרעש, התצלום של כל מקטע נספר שלוש פעמים.

אם אפשר, אימונוהיסטוכימיה צריכה להיות מאומתת על ידי כתם מערבי ובכך אשר את קיומו של עם אפיטופים גודל מולקולרי צפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרולינסקה KID-מימון הרשות, השבדית להגנה מפני קרינה, קרולינסקה עין קרן מחקר, אקדח och רטיל Stohnes Stiftelse, סנט אריק עין חולי קרן המחקר, Ögonfonden, Konung גוסטב החמישי: של och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
  2. Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
  3. Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
  4. Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
  5. McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
  6. Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
  7. Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
  8. Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
  9. McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
  10. Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
  11. Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
  12. Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
  13. Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89, (1), (2011).
  14. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
  15. Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
  16. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
  17. Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
  18. Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  19. Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  20. Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
  21. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
אפיון מנגנונים מולקולריים של<em&gt; בחי</em&gt; UVR מושרה קטרקט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter