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Medicine

के आणविक तंत्र की विशेषता doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

मोतियाबिंद दुनिया में अंधापन का प्रमुख कारण है. सौर पराबैंगनी विकिरण (UVR) मोतियाबिंद के विकास के लिए मुख्य जोखिम कारक है. दूर UVR बी प्रेरित मोतियाबिंद के एक पशु मॉडल विकसित किया गया था. UVR, मात्रात्मक RT-पीसीआर और immunohistochemistry जोखिम: इस लेख में हम मोतियाबिंद गठन की जांच के लिए विधियों का वर्णन.

Abstract

मोतियाबिंद 1 दुनिया में अंधापन का प्रमुख कारण है. विश्व स्वास्थ्य संगठन आंख है जो प्रकाश के हस्तांतरण में बाधा उत्पन्न की लेंस के एक झाई युक्त के रूप में मोतियाबिंद को परिभाषित करता है. मोतियाबिंद एक बहु भाज्य रोग मधुमेह, धूम्रपान, पराबैंगनी विकिरण (UVR), शराब, विकिरण, स्टेरॉयड और उच्च रक्तचाप के साथ जुड़े है. मजबूत 2-4 प्रयोगात्मक और महामारी विज्ञान 5,6 सबूत है कि UVR मोतियाबिंद का कारण बनता है. हम दोनों anesthetized 7 और गैर anesthetized जानवरों में 8 UVR बी प्रेरित मोतियाबिंद के लिए एक पशु मॉडल विकसित किया है.

मोतियाबिंद के लिए केवल इलाज सर्जरी है, लेकिन इस उपचार सभी के लिए सुलभ नहीं है. यह अनुमान लगाया गया है कि मोतियाबिंद के 10 साल के लिए शुरू होने के एक देरी 50 9% से मोतियाबिंद सर्जरी की आवश्यकता को कम कर सकता है. मोतियाबिंद की घटनाओं में देरी, यह मोतियाबिंद गठन के तंत्र को समझने और प्रभावी रोकथाम strat खोजने की जरूरत हैegies. मोतियाबिंद के विकास के लिए तंत्र के अलावा, apoptosis मनुष्य और 10 जानवरों में मोतियाबिंद की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हमारा ध्यान हाल ही में लेंस में मोतियाबिंद 8,11,12 विकास के लिए तंत्र के रूप में apoptosis किया गया है. यह अनुमान है कि apoptosis मार्ग पर एक UVR के प्रभाव की बेहतर समझ नई दवाइयों की खोज के लिए मोतियाबिंद को रोकने के लिए संभावनाओं प्रदान करेगा.

इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे मोतियाबिंद प्रयोगात्मक UVR-B vivo जोखिम में द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. आगे RT-पीसीआर और immunohistochemistry के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं उपकरण UVR बी प्रेरित मोतियाबिंद के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए है.

Protocol

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1. पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में

  1. प्रदर्शन से पहले 15 मिनट, 90 मिलीग्राम / किग्रा (ketamine) Ketalar और intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 10 मिलीग्राम / किग्रा Rompun (xylazine) का एक मिश्रण के साथ एक महिला चूहे Sprague-Dawley anesthetize.
  2. एक चूहे restrainer में पशु प्लेस और एक ट्रंक 13 निचोड़ के कारण के बिना चूहे के स्थिरीकरण जब तक बेल्ट कस.
  3. (Tropicamide) Mydriacyl के लिए mydriasis प्रेरित चूहे की दोनों आंखों में, 10 मिलीग्राम / एमएल, टपकाना.
  4. पशु रखें ताकि कि एक आंख UVR की एक संकीर्ण बीम के खिलाफ आधा अधिकतम 10 एनएम पूरी चौड़ाई के साथ 300 14 एनएम पर तैनात है और काले टेप के साथ contralateral आंख ढाल.
  5. 15 के लिए 300 एनएम 15 मिनट पर चूहे एकतरफा दहलीज उप खुराक 1 kJ / मीटर 2 UVR-B बेनकाब.

2. विच्छेदन

  1. पूर्व निर्धारित पद जोखिम अंतराल (1, 5, 24 और 120 घंटे) के बाद, कार्बो द्वारा छह सप्ताह पुरानी चूहा (वजन <200 ग्राम) के बलिदानn डाइऑक्साइड asphyxiation और ग्रीवा कशेरुक की गड़बड़ी.
  2. मालूम करना आँखें. इसके बाद, कॉर्निया आंख के नीचे डाल दिया, पीछे की ओर. फिर, पंच एक 27 गेज प्रवेशनी लगाने और श्वेतपटल tangentially धक्का लेंस है कि बहुत श्वेतपटल के करीब है हानिकारक से बचने के द्वारा एक न्यूनतम छेद. फिर नेत्र शल्य चिकित्सा कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए किनारी बस के पीछे circumferentially कटौती जब तक श्वेतपटल के पीछे भाग से उठाया जा सकता है. फिर, एक कुंद घुमावदार संदंश के साथ लेंस उठा.
  3. एक खुर्दबीन के नीचे लेंस भूमध्य रेखा से सिलिअरी शरीर के अवशेष निकालें, 5-10 मिनट से संतुलित नमक अब समाधान में लेंस रखने.

3. RT-पीसीआर मात्रात्मक

  1. 350 μl lysis RA1 बफर (NucleoSpin आरएनए द्वितीय कुल शाही सेना अलगाव किट) और 3.5 μl एक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में β mercaptoethanol का एक मिश्रण में एक लेंस रखें.
  2. इस मिश्रण में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान लेंस रखें.
  3. लेंस के साथ homogenizeकेवल लेंस की कड़ी नाभिक तक एक सुई लेंस (प्रांतस्था और लेंस के कैप्सूल lysis बफर में lysed हैं) से छोड़ दिया है. मिश्रण से नाभिक निकालें.
  4. स्टोर तुरंत -70 डिग्री सेल्सियस नमूने
  5. नमूने पिघलना और प्रोटोकॉल "सभ्य कोशिकाओं और ऊतकों से कुल शाही सेना शुद्धि" (NucleoSpin आरएनए द्वितीय कुल शाही सेना अलगाव किट) का पालन करें.
  6. स्टोर आरएनए -70 डिग्री सेल्सियस नमूने
  7. 2 मिनट के लिए 95 ° सी, 40 चक्र के लिए 2 कदम:: प्रत्येक नमूने से डीएनए के लिए पर्याप्त हटाने की पुष्टि करने के लिए, निम्नलिखित शर्तों (1 कदम के तहत एक पीसीआर चलाने के लिए 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 20 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस, 72 ° 20 सेकंड के लिए सी, चरण 3: p53 डीएनए विशिष्ट प्राइमरों के साथ 7 मिनट के लिए 72 ° सी), आगे 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'और रिवर्स 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3 और Taq डीएनए पोलीमरेज़ (dNTPack) निर्माण के अनुसार, प्रोटोकॉल. उम्मीद पीसीआर उत्पाद 243 आधार जोड़े है.
  8. डीएनए 243 बेस जोड़े के विशिष्ट पीसीआर उत्पाद का पता लगाने के लिए एक 1.5% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन चलाएँ. करने के लिए तैयारTbe बफर में 1.5% agarose जेल agarose की 3.75 ग्राम ले और यह tbe बफर के 250 मिलीलीटर में हल. Ethidium ब्रोमाइड (0.5 मिलीग्राम / एमएल) 1.5% agarose जेल समाधान के 500 मिलीलीटर में 500 μl जोड़ें. एक माइक्रोवेव ओवेन में मिश्रण गर्मी और के लिए agarose हल हलचल.

नमूनों में से कोई भी 1.5% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर किसी भी विशिष्ट डीएनए पीसीआर उत्पादों प्रकट करने के लिए है.

  1. शाही सेना के नमूने (1 μl) की एकाग्रता और उपाय एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ND-1000 में 260 (आरएनए) एनएम और 280 एनएम (प्रोटीन) में नमूना absorbance के अनुपात. यदि आरएनए नमूना absorbance के प्रोटीन शाही सेना अनुपात 2.0 या उससे अधिक है तो शाही सेना नमूना शुद्ध है. यदि आरएनए नमूना absorbance के अनुपात के 2.0 की तुलना में कम है, शुद्धि 3.5 कदम शाही सेना फिर से करना.
  2. आरएनए नमूना की 1 ग्राम के लिए इसी मात्रा ले लो और प्रोटोकॉल 1 सेंट Strand सीडीएनए संश्लेषण किट (1 RT-पीसीआर के लिए सेंट किनारा सीडीएनए संश्लेषण किट) के बाद सीडीएनए synthesize.
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए नमूने स्टोर(एक अवधि 1 और अधिक वर्षों के लिए, -70 पर दुकान डिग्री सेल्सियस).
  4. ICycler MyiQ एकल रंग रीयल टाइम पीसीआर प्रणाली का पता लगाने पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर चलाएँ. लोड 1 μl सीडीएनए नमूना, TaqMan जीन एक्सप्रेशन मास्टर मिक्स, कस्पासे 3 के लिए TaqMan जीन एक्सप्रेशन परख के साथ 96 अच्छी तरह से थाली पर triplicates, निर्माण के लिए निर्देशों के अनुसार. लोड 1 μl सीडीएनए नमूना, TaqMan जीन एक्सप्रेशन मास्टर मिक्स, 18s के लिए TaqMan जीन एक्सप्रेशन परख के साथ एक और 96 अच्छी तरह से थाली पर triplicates, निर्देश (TaqMan जीन एक्सप्रेशन परख प्रोटोकॉल) के अनुसार विनिर्माण. श्रृंखला में तीन बेतरतीब ढंग से चुनी गैर उजागर लेंस से सीडीएनए का एक अंश पतला. धारावाहिक dilutions एक साथ चलाने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली में नमूनों से सीडीएनए के साथ.
  5. परिणामों की मात्रा का ठहराव के लिए मानक वक्र विधि का प्रयोग करें. सीमा प्रतिदीप्ति में चक्र की संख्या MyiQ सॉफ्टवेयर में माप के रूप में प्रयोग किया जाता है. एक मानक वक्र अंशशोधक के रिश्तेदार एकाग्रता की दहलीज पर समारोह चक्रों की संख्या के रूप में व्यक्त तों हैएक थाली में धारावाहिक dilutions के लिए tablished. तीन गैर इलाज लेंस नमूनों से सीडीएनए अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था. मानक वक्र प्रत्येक नमूने के लिए चक्र की दहलीज संख्या संबंधित सीडीएनए मापा नमूना के रिश्तेदार एकाग्रता प्राप्त करने के. अंत में, आंतरिक नियंत्रण सीडीएनए 18s सीडीएनए लक्ष्य के सापेक्ष एकाग्रता से संबंधित लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के स्तर मिलता है.

4. Immunohistochemical धुंधला

  1. नियतन
    1. पीबीएस में आंख (7.4 पीएच फास्फेट Saline Buffered) काटना.
    2. एक बर्फ के ठंडे में 4% (पीएफए) 20 मिनट के लिए paraformaldehyde के साथ भरा ट्यूब में आंख रखो. पीएफए ​​4% से पहले दिन तैयार. 4 में स्टोर ° सी का उपयोग करें जब तक. पीएफए ​​लगभग एक सप्ताह के लिए ताजा है.
    3. एक micropipette के साथ पीएफए ​​निकालें. फिर, 20 मिनट के लिए बर्फ का ठंडा पीबीएस के साथ धो लो.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म sucrose 30% में नजर रखो.
    5. आंख एक इष्टतम काटना (अक्टूबर) तापमान मध्यम के साथ भरा कप में रखो (ऊतक)-टेक. सेक्शनिंग के लिए एक उपयुक्त स्थिति में नजर रखो.
    6. सूखी बर्फ पर अक्टूबर - मध्यम में रुक.
    7. -70 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें जब तक.
  2. सेक्शनिंग
    1. स्थिति एक उपयुक्त विमान में क्रायो - सेक्शनिंग के लिए आंख.
    2. प्रत्येक लेंस के मध्य भाग से तीन 5 सुक्ष्ममापी मोटी मध्य बाण के समान वर्गों में कटौती. अनुक्रमिक वर्गों के बीच कम से कम 6 वर्गों को त्यागने के लिए विभिन्न वर्गों में एक ही नाभिक धुंधला से बचने के लिए.
    3. एक बार एक अनुभाग में कटौती की गई है, धीरे यह की चोटी पर एक स्लाइड जगह है. अनुभाग तो स्लाइड पर रहना चाहिए.
    4. उपयोग करने से पहले हवा सूखी स्लाइड छोड़ दें. स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक की आवश्यकता.
  3. प्रतिदीप्ति immunohistochemistry
    1. नमूने को कमरे के तापमान (5-10 मिनट) प्राप्त.
    2. पैप पेन (Invitrogen) के साथ नमूनों के आसपास किनारों ड्रा.
    3. शुष्क थोड़ी देर के (10 मिनट) के लिए सीमा चलो.
    4. खुर्दबीन स्लाइड लेबल.
    5. 1 में rehydrate × पी15 मिनट के लिए बी एस.
    6. 30 मिनट के लिए मानक ब्लॉक समाधान में Permeabilize.
    7. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (खरगोश पॉलीक्लोनल cleaved कस्पासे 3 एंटीबॉडी Asp175 9661, सेल सिगनल प्रौद्योगिकी, इंक) में 1:3,000 पतला मानक ब्लॉक समाधान.
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में एक humidified कक्ष में स्टोर.
    9. पीबीएस में pipetting (3 × 5 मिनट) या एक बड़े स्नान में डुबो (> 15 मिनट, 1-2 परिवर्तन) से धो लें.
    10. माध्यमिक (एक विशिष्ट अवशोषण / उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी) एंटीबॉडी मानक ब्लॉक समाधान में 1:300 पतला जोड़ें.
    11. पीबीएस में pipetting (3 × 5 मिनट) या एक बड़े स्नान में डुबो (> 15 मिनट, 1-2 परिवर्तन) से धो लें.
    12. पीएपी - कलम स्मीयरों से साफ कर लें.
    13. 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में स्टोर. प्रकाश के संपर्क से बचें.
    14. Vectashield की एक बूंद जोड़ें और स्लाइड पर एक कवर पर्ची जगह. बुलबुले बनाने से बचें.
    15. चलो Vectashield कठोर (~ 20 मिनट).
    16. वर्गों मैं रखेंविश्लेषण जब तक अंधेरे n.
    17. सभी नियंत्रण वर्गों प्राथमिक एंटीबॉडी के अभाव में कार्रवाई कर रहे हैं.
    18. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे कुछ घंटों के भीतर परिणाम के लिए देखो.
    19. प्रत्येक लेंस के दूसरे पक्ष परमाणु धनुष एक पक्ष परमाणु धनुष से उपकला सेल नाभिक गिनो. मानक नीला फिल्टर लागू करने के लिए नीले रंग में सभी लेंस उपकला नाभिक और एक मानक फिल्टर है कि माध्यमिक एंटीबॉडी के उत्सर्जन में फिट बैठता है कस्पासे-3 हरी में सकारात्मक नाभिक.
    20. सभी लेंस उपकला नाभिक और सकारात्मक नाभिक की संख्या की संख्या रिकार्ड. कोशिकाओं प्रत्येक अनुभाग के लिए तीन बार की गणना.

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Representative Results

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विचरण का एक विश्लेषण के साथ माप में भिन्नता के विभिन्न स्रोतों का अनुमान किया गया और यह पाया गया कि पशु प्रति तीन माप पर मापन के लिए विचरण जानवरों के लिए उस के 15% के आदेश पर किया गया था. इस प्रकार, पूरे लेंस विश्लेषण पर विचार, यह संभव के लिए सटीक बढ़ाने नहीं है. विषयेतर परीक्षण कस्पासे 3 120 घंटा विलंबता अंतराल बनाम कम विलंबता अंतराल के बीच संदेश के लिए एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण विपरीत elucidated.

Vivo UVR जोखिम में कस्पासे-3 अभिव्यक्ति लाती है.

चित्रा 1
चित्रा 1 पराबैंगनी विकिरण के लिए जोखिम के प्रवाह के योजनाबद्ध.

चित्रा 2
चित्रा 2 के विकास. कस्पासे3 (casp3) क्रिस्टलीय लेंस में 1 kJ / 300 एनएम पर 2 UVR vivo जोखिम में बाद mRNA अभिव्यक्ति. त्रुटि सलाखों उजागर लेंस और contralateral उजागर नहीं लेंस के बीच casp3 mRNA/18s rRNA का मतलब अनुपात के लिए 95% विश्वास अंतराल हैं. मतलब है, ऊपर और नीचे काला लाइन 1 rel. इकाई, क्रमशः, का प्रतिनिधित्व करते हैं और casp3 जीन के नीचे विनियमन.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक उजागर लेंस, और (बी) एक गैर उजागर लेंस में प्रदर्शन के बाद 24 घंटे में अभिव्यक्ति कस्पासे 3 (ए). तीर लेबल की कोशिकाओं दिखाते हैं.

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Discussion

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इस कागज तरीकों का वर्णन करता है कि आणविक UVR बी प्रेरित मोतियाबिंद के दौरान होने वाली घटनाओं का अध्ययन सक्षम करते हैं.

को ध्यान में रखते हुए है कि vivo UVR प्रेरित मोतियाबिंद में सबसे अधिक जानकारी के लिए उपलब्ध सूरजमुखी मनुष्य Sprague-Dawley 7 चूहों, 16, 17, 18, ​​19, प्रयोगों से प्राप्त किया गया था, हम वर्तमान अध्ययन में सूरजमुखी मनुष्य चूहे Sprague-Dawley का उपयोग करने का फैसला किया. चूहों की आयु छह सप्ताह का था. लिंग महिला होने के लिए चुना गया था, क्योंकि पुरुषों के विपरीत, महिलाओं के कम allergenic मूत्र है. इसके अलावा, वहाँ UVR प्रेरित 20 मोतियाबिंद की गंभीरता के संबंध में लिंग में कोई अंतर नहीं है.

सभी जानवरों को रखा गया और नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO वक्तव्य के अनुसार किया जाता है. एथिकल अनुमति अपसला पशु प्रयोगों आचार समिति, प्रोटोकॉल संख्या 10/29 सी से प्राप्त हुई थी. चूहों एक वाणिज्यिक ब्रीडर (Taconic, डेनमार्क) से प्राप्त कर रहे हैं.

तम्बू "> एक नैरोबैंड UVR स्रोत क्रम में spectrally अच्छी तरह से परिभाषित किया जा UVR के लिए चुना गया था चूहे लेंस के अधिकतम UVR-B के लिए संवेदनशीलता के आसपास 300 एनएम. 1 खुराक kJ / 2 मीटर दहलीज खुराक नीचे होने के लिए चुना गया था. 15 15 मिनट का समय जोखिम 21 लेंस के लिए अधिकतम क्षति के लिए प्रेरित करने के लिए चुना गया था UVR-B के लिए जोखिम और समय के बाद जोखिम की खुराक प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.

बनती अंग आंख आँकड़े और पशुओं के अनुसंधान में उपयोग में नैतिकता के मामले में अपने लाभ है. आंख की एकतरफा प्रदर्शन के रूप में उजागर और एक जानवर में नियंत्रण के रूप में एक और पक्ष इस प्रकार यह आधे द्वारा unpaired अंग की तुलना में पशुओं की संख्या को कम कर देता है के लिए एक तरफ का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है.

इस प्रोटोकॉल में हम पशु स्थिरीकरण के लिए एक विधि के रूप में संज्ञाहरण का इस्तेमाल किया. हालांकि, अन्य विकल्प, चूहे 13 restrainer, जो हम हमारी प्रयोगशाला में बनाया गया unanaesthetized जानवरों के स्थिरीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आरएटीएस चूहे restrainer वातानुकूलित यूवी जोखिम से पहले है. यह डिवाइस अच्छी तरह से नियंत्रित दोहराया जोखिम की अनुमति देता है जब संज्ञाहरण इसके दुष्प्रभाव के कारण नहीं की सिफारिश की है. यहाँ, हम एक और anesthetized जानवरों के लिए होल्डिंग डिवाइस स्थिति के रूप में चूहे restrainer इस्तेमाल किया.

चूहे restrainer लकड़ी से बना है और हमारी प्रयोगशाला में कई मदों में उपलब्ध है. हम हमारे निरोधक उपकरण साफ करने से पहले प्रत्येक जानवर पर तैनात है. लकड़ी ब्लॉक, guttering और लकड़ी आश्रयों चूहे पिंजरों में संवर्धन के रूप में किया जाता है. इस तरह के संवर्धन अपसला पशु प्रयोगों आचार समिति और फेडरेशन (यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों के FELASA) ने मंजूरी दे दी है.

लेंस के बीएसएस में समय की छोटी अवधि (5-10 मिनट) में dissected किया जा है. यह प्रतिबंध लेंस स्पष्ट और पारदर्शी रहने के लिए अनुमति देता है.

qRT-पीसीआर

RA1 lysis बफर में लेंस रखने के लिए 30 मिनट का समय है एनough लेंस कैप्सूल और प्रांतस्था को बाधित करने के लिए. लेंस नाभिक 30 मिनट के भीतर कठिन बनी हुई है. लेंस नाभिक, या organelle मुक्त क्षेत्र लेंस की एक प्रतिलेखन गैर सक्रिय हिस्सा माना जाता है. इसलिए, नाभिक नमूना से निकाल दिया जाता है क्रम में mRNA संकेत / शोर अभिव्यक्ति अनुपात में वृद्धि करने के लिए.

विशिष्ट डीएनए शाही सेना (डीएनए की अनुपस्थिति) पवित्रता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल प्राइमर मनमाने ढंग से करने के लिए चुना गया था p53-प्राइमर. विशेष रूप से पशु जीनोम के डीएनए का कोई भी आम तौर पर होने वाली कोडित दृश्यों के लिए चुना जा सकता है. दोनों लेंस अंतराल के बाद जोखिम के प्रति और प्रत्येक लेंस के लिए 10 पशुओं के लिए पीसीआर के साथ विश्लेषण किया गया, कस्पासे 3 आरएनए सामग्री तीन स्वतंत्र मापन में निर्धारित किया गया था.

RT-पीसीआर ब्याज की mRNA को मापने के लिए सक्षम बनाता है. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पूरक डीएनए जो तब पीसीआर से परिलक्षित होता है में mRNA धर्मान्तरित. माप मानक int की सीडीएनए amplifying serially पतला नमूने द्वारा प्राप्त वक्र का उपयोग कर quantified थेerest. एक मानक वक्र लगाने के फायदे हैं कि मानक वक्र एकाग्रता की अनिश्चितता की गणना करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है, और है कि मानक वक्र ब्याज की mRNA की मात्रात्मक मापन प्रदान करता है. वैकल्पिक रूप से, ब्याज की mRNA के सापेक्ष सामग्री सीधे एक मानकीकृत प्रतिदीप्ति संकेत, सीटी विधि प्राप्त करने के लिए आवश्यक चक्र की संख्या की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है. अंशांकन वक्र के मुख्य दोष यह है कि यह सीटी विधि से अधिक जीनोमिक उत्पादों के उपयोग की आवश्यकता है.

Immunohistochemical धुंधला

Immunohistochemistry लेंस उपकला कोशिकाओं में सक्रिय कस्पासे-3 के स्थानिक वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

आँखों तुरंत -70 के लिए जमे हुए थे ° C के लिए सभी चल रहे जैव रसायन बंद करो. आँखें फिर संरक्षण के लिए एक ही तापमान पर संग्रहीत किया गया.

Immunohistochemistry दो सामान्य समर्थक के साथ जुड़ा हुआ हैप्राथमिक एंटीबॉडी और एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन की विशिष्टता, blems. एंटीबॉडी एक अच्छी तरह से नियंत्रित स्रोत से प्राप्त किया जाना चाहिए, इस प्रकार की विशिष्टता की गारंटी. यदि संभव हो, मिलान ऊतक युक्त एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में दाग किया जाना चाहिए. आदेश में गैर विशिष्ट धुंधला हो outrule, यदि संभव हो तो, मिलान विशिष्ट एंटीबॉडी, नकारात्मक नियंत्रण के साथ धुंधला से पहले अवरुद्ध किया जाना चाहिए. इसके अलावा, गैर विशिष्ट धुंधला हो जाना इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता और प्रतिक्रिया समय की स्थापना के द्वारा कम किया जा सकता है. दोनों UVR और ऊतक उजागर UVR करने के लिए नहीं करने के लिए उजागर ऊतक धुंधला करके, यह संभव है UVR प्रेरित मिलान, यहाँ कस्पासे-3 की स्थापना की. Caspapse-3 संकेत व्यक्त कोशिकाओं की गिनती की सुविधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवि डिजिटल रूप में रिकार्ड किया गया था. आदेश में पृष्ठभूमि शोर की भिन्नता को कम करने के लिए, हम सभी खुर्दबीन तस्वीरों के लिए निश्चित सेटिंग्स का उपयोग किया.

पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत की तीव्रता एक सह पर बदलता हैntinuous पैमाने. इसलिए, महत्वपूर्ण धुंधला के लिए एक सीमा के लिए स्थापित किया जाना है. हालांकि, औसत प्रतिदीप्ति spatially यह महत्वपूर्ण धुंधला के लिए एक पूर्ण सीमा का उपयोग करने के लिए मुश्किल बना मनाया अनुभाग के भीतर भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, आम तौर पर विशिष्ट धुंधला हो जाना का निर्णय एक अनुभवी पर्यवेक्षक पर निर्भर करता है और विशिष्ट धुंधला हो जाना के पूर्ण परिणाम अनुभवी पर्यवेक्षक की राय पर निर्भर करता है, लेकिन कि प्रेक्षक के लिए लगातार हो जाएगा. इस कारण से, केवल एक अनुभवी पर्यवेक्षक का इस्तेमाल किया गया था. प्रयोगात्मक चर, UVR के लिए जोखिम की वजह से संकेत में सुधार करने के लिए, के रूप में शोर की तुलना में, प्रत्येक अनुभाग के फोटोग्राफ तीन बार गिना गया था.

यदि संभव हो, immunohistochemistry पश्चिमी धब्बा इस प्रकार की उम्मीद आणविक आकार के साथ epitopes के अस्तित्व की पुष्टि के द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

Och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse: इस काम के कारोलिंस्का Institutet KID धन, स्वीडिश विकिरण संरक्षण प्राधिकरण, कारोलिंस्का Institutet नेत्र रिसर्च फाउंडेशन, गन och Bertil Stohnes Stiftelse, सेंट एरिक नेत्र अस्पताल रिसर्च फाउंडेशन, Ögonfonden, Konung गुस्ताव वी द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
  2. Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
  3. Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
  4. Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
  5. McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
  6. Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
  7. Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
  8. Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
  9. McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
  10. Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
  11. Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
  12. Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
  13. Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89, (1), (2011).
  14. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
  15. Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
  16. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
  17. Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
  18. Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  19. Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  20. Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
  21. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
के आणविक तंत्र की विशेषता<em&gt; Vivo में</em&gt; UVR प्रेरित मोतियाबिंद
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Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

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