इस प्रोटोकॉल स्पंदित कम तीव्रता अल्ट्रासाउंड है, जो फोकल आसंजन गठन और transmembrane मैट्रिक्स रिसेप्टर, syndecan-4 की सगाई की नकल उतार द्वारा Rac1 सक्रियण ड्राइव के साथ सुसंस्कृत fibroblasts की उत्तेजना का वर्णन करता है. इस दृष्टिकोण सेलुलर स्तर पर एक सफल नैदानिक तकनीक की जांच की अनुमति देता है, जिससे चिकित्सा के शोधन के लिए अवसर प्रदान.
In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with α5β1-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.
The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal3, causes integrin redistribution1, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions4, and thereby induces directional migration3. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement5. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm2, 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair6. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage α5β1-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.
इस प्रोटोकॉल में हम विधि है जिसके द्वारा एक इलाज है कि सामान्य रूप से मानव रोगियों को लागू किया जाता है सेल आधारित प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. अंतिम लक्ष्य के अल्ट्रासाउंड कार्रवाई की आणविक तंत्र को समझने के लिए इतना है कि चिकित्सा परिष्कृत किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक मॉडल सेल प्रणाली के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के उपयोग करते हैं, लेकिन अल्ट्रासाउंड भी किया गया है प्राथमिक मानव चमड़ी 5 fibroblasts, mesenchymal स्टेम सेल, अस्थिकोरक और 6 chondrocytes में प्रभावी होना पाया गया. हम एक उदाहरण जैव रासायनिक परख के रूप में Rac1 सक्रियण का उपयोग करें, लेकिन विधि के समान रूप से प्रोटीन phosphorylation या immunoprecipitation द्वारा प्रोटीन परिसरों के गठन के विनियमन का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Immunofluorescent उदाहरण के लिए हम फोकल आसंजन गठन पर एक प्रभाव अल्ट्रासाउंड का प्रदर्शन, लेकिन किसी भी अणु के पुनर्वितरण की जांच जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक प्लाज्मा झिल्ली साइटोसोलिक कारकों की भर्ती परीक्षा, prote की colocalisationतस्करी vesicles में भारतीय नौसेना पोत या mitotic धुरा संगठन पर अल्ट्रासाउंड के प्रभाव की जांच. अब तक हम खुद लिए fibronectin निर्भर रास्ते का परीक्षण करने के लिए, कोलेजन पर, या वृद्धि कारकों की उपस्थिति में कैसे अल्ट्रासाउंड एक जटिल माहौल में सेल व्यवहार को प्रभावित करता है की एक तस्वीर बनाने के लिए परीक्षण किया जा सकता है अल्ट्रासाउंड की कोशिकाओं पर प्रभाव सीमित है कि अधिक निकट एक में vivo में स्थिति जैसा दिखता है. एक बड़ी चुनौती के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर समय चूक इमेजिंग, जहां emitter की उपस्थिति अल्ट्रासाउंड वर्तमान अतिरिक्त तकनीकी बाधाओं से अवरुद्ध प्रकाश पथ और कंपन के प्रभाव का परीक्षण होगा. हालांकि, तथ्य यह है कि चिकित्सकीय आवेदन उत्तेजना के प्रति दिन केवल 20 मिनट की आवश्यकता का पता चलता है कि उत्तेजना का एक फट के बाद सेल के व्यवहार के विश्लेषण अच्छी तरह से हो सकता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के वेलकम ट्रस्ट अनुदान ०८८४१९ द्वारा MDB और प्रायोजन के लिए स्मिथ और उनके भतीजे ब्रिटेन लिमिटेड द्वारा समर्थित किया गया
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |