Summary
Этот протокол описывает стимуляции культуре фибробластов с низкой интенсивностью импульсного ультразвука, который управляет координационный спаек и Rac1 активации, имитируя участие рецепторов трансмембранного матрицы, syndecan-4. Такой подход позволяет исследовать успешные клинические техники на клеточном уровне, обеспечивая тем самым возможности для уточнения терапии.
Protocol
1. Покрытие поверхности с матрицей лигандов
- Ультразвуковое будет применяться к ячейкам в 3,5 см скважины, либо как отдельные блюда или 6-луночного планшета. Для биохимических анализов, пальто лиганда непосредственно на пластик. Для иммунофлюоресценции, варить стекло покровные три раза в MilliQ воды и место 4 покровные на дно каждой лунки.
- Стеклянные поверхности должны быть производные для обеспечения эффективного покрытия лиганда. Растворите сульфо-м-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide эфир в PBS в 1 мм. Добавить 2 мл в каждую лунку и инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
- Вымыть поверхность производные 3 раза PBS.
- Пальто или производные стекла или пластика с необработанными лигандов интегрина. Применяют по 2 мл 10 мкг / мл интегрина ligand9, растворенного в PBS, содержащем Ca 2 + и Mg 2 + в каждую лунку и инкубировать в течение ночи при 4 ° C.
- Подготовить monoparticulate BSA путем нагревания 1% BSA, растворенного в PBS, до 85 ° C в течение 13 минут. Позволятьостыть, а затем пройти через 0,45 мкм фильтр.
- Вымойте лиганда покрытием поверхности 3 раза PBS и блок с monoparticulate BSA в течение 30 минут.
2. Подготовка клетки
- Для управления матрицей окружающей среды в течение всего эксперимента, синтез белка должны быть заблокированы путем добавления 25 мкг / мл циклогексимид до 80% сливной фибробластов в течение 2 часов.
- Промыть циклогексимид обработанных клеток PBS и отделить от культуры фляги использовании 0,5 мг / мл трипсина / ЭДТА.
- Урожай отдельных клеток путем центрифугирования при 500x г в течение 5 минут.
- Ресуспендирования клеток в DMEM/25 HEPES мМ, 25 мкг / мл циклогексимид.
- Граф плотность клеток суспензии помощью гемоцитометра и развести в 105 мл-1.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 20 минут для восстановления поверхности интегринов.
- Промойте лиганда покрытием, BSA-заблокировали лунки 3 раза PBS.
- Семенной 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку.
- Аллош клетки распространились в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО 2.
3. Ультразвуковая стимуляция
- Теплый массива ультразвуковой излучатель и связи гель до 37 ° C.
- Нанесите горошину капля геля для связи каждого излучателя.
- Проверьте, что каждый излучатель функционально помощью диодного индикатора ультразвукового детектора.
- Поместите скважин на эмиттере массива. Возвращает массив до 37 ° C, 5% СО 2 и температуры позволяют, чтобы уравновесить в течение 10 минут.
- Включите ультразвукового сигнала.
- Ультразвуковой сигнал отключается после 20 минут, имитируя терапевтический режим. Если сокращение времени стимуляции требуется, плиты должны быть удалены из массива в нужный момент точки. Во всех случаях использование нестимулированных пластин в качестве отрицательного контроля.
4. Фокусное анализ сцепления иммунофлуоресценции
- Для анализа координационных спаек, применяется 20-минутный ультразвукового сигнала, а затем позволить структуры для разработки еще на 40 минут на поддержание клеток при 37 ° C, 5% СО 2.
- Аспирируйте СМИ и исправить клеток путем применения 2 мл 4% параформальдегида в ФСБ. Инкубировать 14 минут при комнатной температуре.
- Аспирируйте параформальдегид и промыть три раза PBS, применяя PBS мягко край колодца, чтобы избежать генерации поперечных сил.
- Передача каждого из покровного 3,5 см и на 24-луночного планшета для последующего иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Угашайте остаточной параформальдегид, применяя 0,5 мл 0,1 М глицина в PBS в каждом из 24 скважин. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
- Аспирата глицин и промыть три раза PBS.
- Permeabilise клетки, применяя 0,5 мл 0,5% Тритон Х-100 (вес / объем) в PBS. Выдержите в течение 4 минут при комнатной температуре.
- Аспирата Тритон Х-100 и промыть три раза PBS.
- Блока, применяя 0,5 мл 3% (вес / объем) BSA в PBS. Инкубируйте течение ночи при 4-йнапример, C.
- Пятно винкулин содержащих координационные сцепления с hVIN-1 антител 1:400 разбавляется в блоке БСА. Выдержите в течение одного часа при комнатной температуре.
- Промыть три раза PBS.
- Применить флуорофора (DyLight 488) конъюгированные вторичные антитела (разбавленный 1:200) и пятно актина с TRITC-сопряженных фаллоидином (разбавленный 1:200) в блоке БСА. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
- Промыть три раза PBS, и один раз с водой.
- Установите на предметное стекло в перевернутом положении с помощью Продлить Золото mountant.
5. Количественная Rac1 Активация выпадающего Пробирной
- Для анализа Rac1 активации, применяется 20-минутный ультразвуковой сигнал в клетки при 37 ° C, 5% СО 2. При оценке ответа раза больше, чем за 20 минут, применять ультразвукового сигнала в течение 20 минут и поддержания клеток при 37 ° C, 5% СО 2 в течение оставшегося времени, чтобы в ответ на развитие.
- Аспирата СМИ и место хорошос на льду. Промыть скважин с 2 мл холодного PBS и аспирации. Убедитесь, остаточные PBS удаляется, оставляя скважин наклонена в течение 1 минуты с последующим тщательным аспирации.
- Лизировать клетки на льду с 35 мкл буфера для лизиса (10% глицерин, 20 мМ Hepes рН 7,4, 140 мМ NaCl, 1% NP40, 0,5% натрия Deoxycholate, 4 мм EGTA, 4 мМ ЭДТА, 1 × полный ингибитор протеазы) в каждую лунку. В этом примере, 6 скважин используется в момент времени генерировать 210 мкл клеточного лизата. Более или менее скважин могут быть использованы, но общий объем лизата должна составить ~ 200 мкл.
- Скрип клетки тщательно клетки скребок, чтобы обеспечить полный лизис клеток и оставить скважин наклонена в течение 1 минуты, чтобы лизат в бассейн.
- Передача лизата в ледяной 1,5 мл микроцентрифужную трубки (объединение лизатов из одного режима лечения) и спина в 21000 х г в течение 2 минут при температуре 4 ° С до обломков гранул сотовых.
- Передача 180 мкл лизата в ледяной 1,5 мл микроцентрифужную пробирки, содержащие 130 мкл лизирующего буфера и 25 мкл ПАК-перенасыщениеathione агарозном бусин 10. Держите остальные сырой лизат при -20 ° С для последующего разделения геля.
- Захват активного Rac1 на ПАК-глутатион бисером агарозном поворотом трубы в течение 40 минут при 4 ° C.
- Урожай агарозном шарик конъюгатов центрифугированием при 2000 × г в течение 1 минуты при температуре 4 ° C.
- Wash шарик сопрягает три раза с 500 мкл буфера для лизиса, сбор бисером центрифугированием при 2000x г и отбрасывая супернатант после каждого мытья. Осторожно удалите оставшиеся промывочного буфера лизис с 200 мкл пипетки.
- Элюирования каждого образца путем добавления 35 мкл SDS-PAGE буфера загрузки и инкубировать при 85 ° C на дрожащей тепло блока в течение 5 минут. Удалить бисером центрифугированием при 21000 х г в течение 1 минуты.
- Решение шарик элюата на SDS-PAGE, передать нитроцеллюлозы и зонд для Rac1.
6. Представитель Результаты
В этом протоколе описываются индукции винкулин-пятноED Фокусное спайки и Rac1 деятельности с помощью ультразвука. Для координационного эксперимент адгезии, базовые позиции является то, что фибробласты распространяется на лигандом α 5 β 1 интегрина не образуют винкулин содержащих спайки (рис. 3А), если второй рецептор фибронектина, syndecan-4, занимается добавлением растворимого лиганда (рис. 3В) 3,4. Тем не менее, стимуляция с помощью ультразвука вызывает координационного спаек в той же степени, как участие syndecan-4 (рис. 3в), о том, что ультразвуковая стимуляция может заменить некоторые компоненты фибронектин-зависимого сигнального пути 5. Главное препятствие этому протоколу устранения координационного спаек в отсутствии стимулятор. Неполное подавление синтеза белка циклогексимид позволит матрицы осаждения, что является достаточным для клеток автоматически стимулировать. Переполнение клеток может привести к низким уровнем адгезии координационного formatioя и плохой ответ на ультразвук, как перекрестные помехи между клетка-клетка и клетка-матрица контакты будут усложнять эксперимент, который предназначен для изоляции одного стимула. В развитие основного анализа мы покажем такой же эксперимент, повторить с фибробластами хватает syndecan-4 (рис. 4). Эти фибробласты еще реагировать на ультразвуковое исследование (рис. 4в), но не реагируют на syndecan-4 лиганда (рис. 4В). Эксперимент с использованием Sdc4 - / - фибробласты показывают, что ультразвук может действительно обойти необходимость определенных рецепторов фибронектин, и показывает, как простой протокол может быть разработан, чтобы получить дополнительную информацию о сигнального пути.
Для биохимического эксперимента показали, что ультразвук может вызывать активацию Rac1, используя выпадающее анализа, что является адаптацией метода, описанного Del Pozo и соавт. 10. Осадки активного Rac1 0, 10, 30 и 60 минут после иниtiation ультразвуковой стимуляции показывает, что Rac1 пики активности на 10-30 минут, прежде чем вернуться к исходным (рис. 5). Уничтожается сырой лизатов для винкулин обеспечивает эквивалентную нагрузку между моментами времени. Результат напоминает активации Rac1 на участие syndecan-4 3, но немного более длительным, чем активация фибронектина. Поэтому 8-10 повторов, как правило, необходимы для достижения важных данных. Активация Rac1 несет ответственность за совершение клеток координационных спаек и спайки зарождающейся координационного начинают формироваться на 10-30 минут, совпадающие с Rac1 активации. Как только начаты, эти спайки будет назревать в больших бляшек сцепления показано на рисунках 3 и 4.
Рисунок 1. Формы ультразвуковой волны. Ультразвуковое включает прерывистый сигнал 1,5 МГц, что в связи с малой амплитудой (30 мВт / см <sup> 2, пространственное среднее, среднее временное) не имеет тепловой эффект.
Рисунок 2. Схема рабочего процесса для подготовки и стимуляции клеток с помощью ультразвука.
Рисунок 3. Ультразвуковая индукции координационных спаек в фибробласты. Фибробласты были распространены на интегрин-связывающий фрагмент фибронектина (A) до стимуляции syndecan-4-связывающий фрагмент фибронектина (B) или ультразвука (C). После 60-минутной стимуляции клетки фиксировали, окрашивали для винкулин и актин, и изображено эпифлуоресцентной. Bar = 10 мкм.
Рисунок 4. Ультразвуковое индукции координационных спаек в фибробластах отсутствует syndecan-4.
Рисунок 5. Активизация Rac1 с помощью ультразвука. Клетки были стимулированы на 0, 10, 30 и 60 минут с 6 скважин использованы в момент времени. Количество ГТФ-Rac1 присутствующих в образцах Rac1 выпадающего конечно время анализа было визуализировать путем инкубации с анти-Rac1 антител на западном пятно (верхний рисунок). Количественная оценка интенсивности полосы (в среднем 8-10 повторяет) показывает, увеличилось Rac1ctivity в результате ультразвукового сигнала в 10 и 30 минут, прежде чем вернуться к исходному уровню на 60 минут (график). Ошибка бары представляют сем
Discussion
В этом протоколе описываются способ, которым лечение, которое обычно применяется для человека пациенты могут быть использованы в клеточных экспериментов. Конечная цель заключается в понимании молекулярного механизма действия ультразвука, так что лечение может быть уточнена. В этом протоколе, мы используем мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) как систему ячейка модели, но ультразвук был также признан эффективным в первичных человеческих фибробластов крайней плоти 5, мезенхимальные стволовые клетки, остеобласты и хондроциты 6. Мы используем Rac1 активации, например, биохимический анализ, но метод может быть использован в равной степени для проверки регулировании фосфорилирования белка или образование белковых комплексов по иммунопреципитации. Для иммунофлуоресцентного примере продемонстрировать влияние ультразвука на координационных спаек, но перераспределение любая молекула может быть рассмотрена. Например, можно проверить набор цитозольного факторов плазматической мембраны, colocalisation из proteмодулей в торговле пузырьки или изучения влияния ультразвука на митотический организации шпинделя. До сих пор мы ограничивались тестирование фибронектина зависит от пути, под действием ультразвука на клетки на коллаген, или в присутствии факторов роста могут быть проверены создать картину того, как ультразвук влияет на поведение клеток в сложных условиях, что более напоминает ситуацию в естественных условиях. Более сложной задачей будет проверить влияние ультразвука использованием покадровой обработки изображений, где присутствие эмитента блокирует путь света и вибраций от ультразвукового настоящее время дополнительные технические трудности. Тем не менее, тот факт, что терапевтическое применение требует только 20 минут в день стимуляция предполагает, что анализ поведения клеток после взрыва стимуляция может быть продуктивным.
Disclosures
Эндрю Харрисон сотрудник Smith & Nephew Великобритании Limited.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Wellcome Trust грант в 088 419 МБР и спонсорство Smith & Nephew Великобритании ООО
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
References
- Bass, M. D. A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis. Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).
- Echtermeyer, F. Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4. J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).
- Bass, M. D. Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix. J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).
- Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments. Embo. J. 5, 665-670 (1986).
- Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1. J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).
- Claes, L., Willie, B. The enhancement of bone regeneration by ultrasound. Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).
- Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound. J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).
- Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study. J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).
- Danen, E. H. Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1. J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).
- Makarem, R. Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1. J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).
