このプロトコルは、接着斑の形成と膜貫通マトリックス受容体、シンデカン-4の関与を模倣することによってRac1の活性化を駆動する低強度パルス超音波による培養線維芽細胞の刺激を説明しています。このアプローチは、それによって治療法の改良の機会を提供する、細胞レベルで成功した臨床技術の調査を可能にします。
多細胞生物において、細胞の挙動は細胞外マトリックスとの相互作用によって決定されます。細胞の遊走と増殖の調節から、分泌、さらに分化に行列係範囲の結果。これらの複雑なプロセスのそれぞれの基礎となる信号は、細胞の表面上の細胞外マトリックス受容体の分子間相互作用から生じる。インテグリンは原型の受容体であると機械的な細胞外マトリックスと細胞骨格の間のリンクと同様に、接着依存性のシグナル伝達カスケードのいくつかを開始することを提供しています。しかし、それは追加の膜貫通受容体がインテグリン下流そのものと信号の両方を調節するインテグリンと一緒に機能していることをますます明らかになっています。これらの例の中で最もエレガントなフィブロネクチンへの接着時のα5β1インテグリンと協力して貫通プロテオグリカン、シンデカン- 4である。in vivoモデルdemonstr でシンデカン-4ノックアウトマウスは非効率的な線維芽細胞への移行1,2による治癒遅延を示すように、シンデカン- 4シグナリングの重要性を食べました。野生型動物では、傷に向かって線維芽細胞の移行は、破損した毛細血管からリークとは、負傷した組織内のマクロファージによって堆積されているフィブロネクチンの出現によってトリガされます。したがって、フィブロネクチン – 依存性のシグナル伝達を強化し、修復プロセスを加速させることができる戦略を発見することに大きな関心があります。
インテグリン媒介およびフィブロネクチン – 依存性のシグナル伝達のシンデカン-4を介したコンポーネントの組換えフィブロネクチンフラグメントによる刺激細胞で分離することができます。インテグリンの関与は、細胞接着に必須であるが、特定のフィブロネクチン – 依存性の信号は、シンデカン – 4で規定されている。シンデカン-4活性化Rac1の突出信号3は 、焦点にインテグリン配布1、などビンキュリンなど細胞骨格分子のトリガ募集を引き起こし、癒着4、それによって方向性のある移動3を誘導する 。我々はこのようなシグナルを活性化するための代替戦略を見て、低強度パルス超音波(LIPUS)がシンデカン- 4婚約5の効果を模倣できることを見出した。このプロトコルでは、我々は、1 kHz( 図1)でパルスで30 MW / cm 2と 、1.5 MHzの超音波検査方法は、Rac1の活性化と接着斑の形成を誘導する培養中の線維芽細胞( 図2)に適用することができますについて説明します。このパラメーターの組み合わせは、臨床骨折修復6の加速のための最も効果的であることが判明しているように超音波刺激は、20分の最大値に適用される。メソッドは、シンデカン-4の関与なしにα5β1インテグリンを、従事する組換えフィブロネクチンフラグメントを使用しており、線維芽細胞による追加的な行列の沈着を阻止するシクロヘキシミドによるタンパク質合成の阻害を必要とします。、正の効果O修復機構のF超音波はよく7,8に記載されていると、文化の中で超音波の分子の影響を理解することによって我々は臨床転帰を改善する治療技術を改良することができるはずです。
このプロトコルでは、我々は通常、人間の患者に適用される治療は、細胞ベースの実験で使用することができる方法について説明します。究極の目標は、治療が洗練されたことができるように超音波作用の分子機構を理解することです。このプロトコルでは、モデル細胞系としてマウス胚繊維芽細胞(MEF)を使用していますが、超音波は、初代ヒト包皮線維芽細胞5、間葉系幹細胞、骨芽細胞および軟骨細胞6で有効であることが判明してされています。ここでは、例の生化学的アッセイとしてRac1の活性化を使用していますが、方法は同様にタンパク質のリン酸化や免疫沈降によるタンパク質複合体の形成の調節をテストするために使用することができます。免疫例では、接着斑形成に効果の超音波を発揮しますが、分子の再配分を検討することができます。たとえば、一つはproteのcolocalisation、形質膜への細胞質因子の補充をテストすることができます人身売買の小胞のプラグインまたは有糸分裂紡錘体の組織に超音波の効果を調べる。これまでのところ我々は、自身がコラーゲンで、または成長因子の存在下で超音波は、複雑な環境下で細胞の挙動にどのような影響を与えるかの画像を構築するためにテストすることができ、細胞に超音波の効果により、フィブロネクチン – 依存性経路をテストするために閉じ込められたことをより多くの密接にin vivoでの状況は似ています。大きな課題は、エミッタの存在は超音波検査現在、追加の技術的な障害からの光パスや振動を遮断するタイムラプスイメージングを使用して、超音波の効果をテストすることになります。しかし、治療への応用は、日あたりの刺激のわずか20分を必要とするという事実は、刺激のバースト後の細胞の挙動の分析がよく生産性を得ることを示唆している。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、スミス·アンド·ネフュー英国株式会社によってMDBとスポンサーにウェルカムトラスト助成金088419によってサポートされていました
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |