Denne protokol beskrives stimuleringen af dyrkede fibroblaster med lav intensitet pulserede ultralyd, som driver fokal adhesionsdannelse og Rac1 aktivering ved at efterligne indgreb af transmembrane matrix-receptor, syndecan-4. Denne fremgangsmåde muliggør undersøgelse af et succesfuldt klinisk teknik på det cellulære niveau, hvorved der tilvejebringes mulighed for forbedring af behandlingen.
I multicellulære organismer, er cellen adfærd dikteret af interaktioner med den ekstracellulære matrix. Konsekvenser af matrix-engagement spænder fra regulering af celle-migration og proliferation, til sekretion og endda differentiering. De signaler, der ligger til grund hver af disse komplekse processer stammer fra molekylære vekselvirkninger ekstracellulære matrix-receptorer på overfladen af cellen. Integriner er det prototypiske receptorer og tilvejebringe en mekanisk forbindelse mellem ekstracellulær matrix og cytoskelettet, samt initiering nogle af de adhæsionsafhængige signaleringskaskader. Dog bliver det stadig mere tydeligt, at yderligere transmembrane receptorer fungere sammen med de integrinerne at regulere både integrinet selv og signaler nedstrøms. Den mest elegante af disse eksempler, er det transmembrane proteoglycan, syndecan-4, der samvirker med α 5 β 1-integrin i adhæsion til fibronectin. In vivo-modeller demonstrspiste betydningen af syndecan-4-signalering, som syndecan-4-knockout-mus udviser heling retardering grund af ineffektiv fibroblast migration 1,2. I vildtype-dyr, er migration af fibroblaster mod et sår udløst ved fremkomst af fibronectin, som lækker fra beskadigede blodkar og deponeres af makrofager i beskadigede væv. Derfor er der stor interesse i at finde strategier, der forbedrer fibronectin-afhængige signaler og kan fremskynde reparation processer.
Integrin-formidlede og syndecan-4-medieret komponenter i fibronectin-afhængige signaler kan adskilles ved at stimulere cellerne med rekombinante fibronectinfragmenter. Selv integrin indgreb er nødvendigt for celleadhæsion har visse fibronectin-afhængige signaler reguleres af syndecan-4. Syndecan-4 aktiverer Rac1 protrusive signal 3, forårsager integrin omfordeling en udløser rekruttering af cytoskeletale molekyler, såsom vinculin til fokalsammenvoksninger 4, og dermed inducerer retningsbestemt migration 3. Vi har søgt efter alternative strategier til aktivering af sådanne signaler og fandt, at lav intensitet pulseret ultralyd (LIPUS) kan efterligne virkningen af syndecan-4 indgreb 5. I denne protokol beskrives den fremgangsmåde, ved hvilken 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultralyd, pulseret med 1 kHz (fig. 1) kan anvendes til fibroblaster i kultur (fig. 2) for at inducere Rac1 aktivering og fokal adhesionsdannelse. Ultralyd stimulation anvendes i maksimalt 20 minutter, idet denne kombination af parametre har vist sig at være mest effektiv til fremskyndelse af klinisk frakturreparation 6. Fremgangsmåden anvender rekombinante fibronectinfragmenter at udøve α 5 β 1-integrin, uden indgreb af syndecan-4, og kræver inhibering af proteinsyntesen ved cycloheximid til at blokere aflejring af yderligere matrix af fibroblasterne., Positive virkning of ultralyd på reparations-mekanismer er veldokumenteret 7,8, og ved at forstå den molekylære effekten af ultralyd i kultur, vi bør være i stand til at forfine den terapeutiske teknik til at forbedre de kliniske resultater.
I denne protokol beskrives den metode, som en behandling, som normalt anvendes til humane patienter, kan anvendes i celle-baserede eksperimenter. Det ultimative mål er at forstå den molekylære mekanisme af ultralyd handling, således at behandlingen kan forbedres. I denne protokol anvender vi muse embryonale fibroblaster (MEF) som model cellesystem, men ultralyd har også vist sig at være effektive i primære humane forhudsfibroblaster 5, mesenchymale stamceller, osteoblaster og chondrocytter 6. Vi anvender Rac1 aktivering som eksempel biokemisk assay, men fremgangsmåden kan anvendes også til at teste regulering af proteinphosphorylering eller dannelse af protein-komplekser ved immunfældning. For immunofluorescent eksempel vil vi vise en effekt ultralyd på fokal adhæsion dannelse, men en omfordeling af ethvert molekyle, der kan undersøges. For eksempel kunne man teste rekruttering af cytosoliske faktorer til plasmamembranen, colocalisation af proteins i menneskehandel vesikler eller undersøge effekten af ultralyd på mitotiske spindel organisation. Hidtil har vi begrænset os til at teste fibronektin-afhængige veje, ved effekten af ultralyd på celler på kollagen, eller i tilstedeværelse af vækstfaktorer kan testes for at opbygge et billede af, hvordan ultralyd påvirker celle adfærd i et komplekst miljø, der mere ligner en in vivo situation. En større udfordring vil være at afprøve effekten af ultralyd ved hjælp af time-lapse billeddannelse, hvor tilstedeværelsen af emitter blokerer lyset stien og vibrationer fra de ultralyd nuværende yderligere tekniske forhindringer. Den omstændighed, at den terapeutiske applikation kræver kun 20 minutter stimulering per dag antyder, at analyse af cellen adfærd efter en byge af stimulation kan meget vel være produktiv.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust tilskud 088419 til MDB og sponsorering af Smith & Nephew Storbritannien Ltd
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |