本协议描述成纤维细胞与低强度脉冲超声波的刺激,从而推动粘着形成和Rac1激活通过模仿跨膜基质受体,降解syndecan-4参与。这种方法允许在细胞水平上一个成功的临床技术的调查,从而提供了完善的治疗机会。
在多细胞生物体中,细胞的行为是通过与细胞外基质的相互作用决定的。矩阵参与范围从调节细胞迁移和增殖,分泌和即使分化的后果。基本每个这些复杂的过程所产生的信号从细胞外基质受体的细胞表面分子间的相互作用。整合的原型受体与提供细胞外基质和细胞骨架之间的机械连接,以及发起的一些粘附依赖的信号转导通路。然而,它正变得越来越明显,额外的跨膜受体旁边的整合功能,调节下游的整合和信号。这些例子中最优雅的跨膜蛋白多糖,降解syndecan-4,α5β1整合与合作过程中粘附到纤维连接蛋白在体内模型demonstr吃的syndecan-4信号的重要性,作为降解syndecan-4基因敲除小鼠表现出愈合迟缓,由于低效的成纤维细胞迁移1,2。在野生型动物,所引发的纤维连接蛋白的外观,从受损的毛细血管渗漏和沉积在损伤组织巨噬细胞迁移的成纤维细胞向伤口。因此有极大的兴趣,增强纤维连接蛋白依赖的信号,并可以加快修复过程中发现战略。
纤维连接蛋白依赖的信号介导的整合和降解syndecan-4-介导的组件可以通过刺激细胞分离与重组纤维连接蛋白片段。虽然整合的参与是必不可少的细胞粘附,某些纤维连接蛋白依赖的信号受降解syndecan-4。降解syndecan-4激活Rac1的前伸的信号,使整合再分配1,触发细胞骨架分子,如纽,招聘,联络粘连,从而诱导定向迁移3。我们寻找替代战略激活这些信号,并发现,低强度脉冲超声波(LIPUS)可以模仿的syndecan-4参与的影响。在这个协议中,我们描述了30毫瓦/平方厘米 ,1.5兆赫超声波,1 kHz时( 图1)脉冲,可应用于文化中的成纤维细胞( 图2)诱导Rac1的激活和粘着形成的方法。超声刺激,最多为20分钟,这个参数的组合已被发现是最有效的加速临床骨折修复6。该方法采用重组纤维连接蛋白片段进行α5β1整合,没有参与的syndecan-4,需要由放线菌酮抑制蛋白质的合成,阻止成纤维细胞额外的基质沉积。,Ø积极作用f在修复机制的超声是有据可查的7,8,了解文化的超声分子的影响,我们应该能够改进治疗技术,以提高临床疗效。
在这个协议中,我们描述了可以在基于细胞的实验中使用的方法,通常应用于人类患者的治疗。最终的目标是可以提炼治疗的分子机制,使了解超声波行动的。在这个协议中,我们使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)作为细胞模型系统,但超声也已被发现在人包皮成纤维细胞的主要5,间质干细胞,成骨细胞和软骨细胞6有效。我们用一个例子生化检测Rac1的激活,但同样的方法可以用来测试调节蛋白磷酸化或通过免疫蛋白复合物的形成。为免疫的例子,我们证明上粘着形成的影响超声,但可以审查任何分子的再分配。例如,可以测试的细胞膜,细胞质因素招聘蛋白酶colocalisation插件贩运囊泡或超声检查对有丝分裂纺锤体组织的影响。到目前为止,我们只限于自己来测试纤维连接蛋白依赖性途径,通过超声波对细胞的影响,胶原蛋白,或生长因子的存在,可以测试超声在复杂的环境影响细胞的行为如何建立一个图片类似于在体内的情况。一个更大的挑战将是检验超声使用时间推移成像,在场发射超声额外的技术障碍阻止光路和振动的影响。然而,治疗中的应用刺激,每天只需要20分钟的事实表明,一阵刺激后的细胞行为的分析,很可能是富有成效的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了威康信托基金赠款088419 MDB和赞助施乐辉英国有限公司
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |