Dit protocol beschrijft de stimulatie van de gekweekte fibroblasten met een lage-intensiteit gepulseerd ultrageluid, die focal adhesion vorming en Rac1 activering door het nabootsen van betrokkenheid van de transmembraan-receptor matrix, syndecan-4-drives. Deze benadering maakt het onderzoek van een succesvolle klinische techniek op cellulair niveau, waardoor het bieden van mogelijkheden voor verfijning van de therapie.
In meercellige organismen, wordt cel gedrag bepaald door interacties met de extracellulaire matrix. Gevolgen van matrix-betrokkenheid variëren van regulatie van cel-migratie en proliferatie, om afscheiding en zelfs differentiatie. De signalen onderliggende elk van deze complexe voortkomen uit de moleculaire interacties van extracellulaire matrix receptoren op het oppervlak van de cel. Integrinen zijn de prototypische receptoren en een mechanische koppeling tussen extracellulaire matrix en het cytoskelet, en het initiëren enkele hechting afhankelijk signaleringscascades. Wordt echter steeds duidelijker dat extra transmembraanreceptoren functioneren naast de integrinen zowel de integrine zelf en signalen stroomafwaarts regelen. De meest elegante van deze voorbeelden is de transmembraan proteoglycanen, syndecan-4, die met α 5 β 1-integrine werkt tijdens de hechting aan fibronectine. In vivo modellen demonstraten het belang van syndecan-4 signalering, zoals syndecan-4-knockout muizen vertonen genezing vertraging te wijten aan inefficiënte fibroblast migratie 1,2. In de wild-type dieren, wordt de migratie van fibroblasten in de richting van een wond veroorzaakt door de verschijning van fibronectine die lekken uit de beschadigde haarvaten en wordt afgezet door macrofagen in beschadigd weefsel. Daarom is er grote belangstelling voor het ontdekken van strategieën die fibronectine-afhankelijke signalering te verbeteren en te versnellen kunnen herstelprocessen.
De integrine gemedieerde en syndecan-4-gemedieerde componenten van fibronectine afhankelijke signalering kan worden gescheiden door het stimuleren van cellen met recombinante fibronectine fragmenten. Hoewel integrine betrokkenheid is essentieel voor celadhesie, worden bepaalde fibronectine-afhankelijke signalen gereguleerd door syndecan-4. Syndecan-4 activeert het Rac1 stuwend signaal 3, zorgt ervoor dat integrine herverdeling 1, triggers werving van het cytoskelet moleculen, zoals vinculine, aan focaladhesies 4 en veroorzaakt daarbij richting migratie 3. We hebben gezocht naar alternatieve strategieën voor het activeren van deze signalen en vond dat een lage intensiteit gepulseerd ultrageluid (LIPUS) kunnen de effecten van syndecan-4 betrokkenheid 5 na te bootsen. In dit protocol beschrijven we de wijze waarop 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultrageluid gepulseerd bij 1 kHz (fig. 1) kan worden toegepast fibroblasten in kweek (fig. 2) Rac1 activering en focal adhesievorming induceren. Ultrasound stimulatie wordt toegepast maximaal 20 minuten, de combinatie van parameters is gevonden het meest doeltreffend voor het versnellen van klinische breuk reparatie 6. De methode maakt gebruik van recombinante fibronectine fragmenten aan α 5 β 1-integrine, gaan zonder engagement van syndecan-4, en vereist remming van de eiwitsynthese door cycloheximide tot afzetting van extra matrix te blokkeren door de fibroblasten., Het positieve effect of ultrageluid op herstelmechanismen is goed gedocumenteerd 7,8, en door het begrijpen van de moleculaire werking van ultrageluid in de cultuur moeten we in staat zijn om de therapeutische techniek te verfijnen om de klinische resultaten te verbeteren.
In dit protocol beschrijven we de wijze waarop een behandeling die gewoonlijk wordt gebruikt voor humane patiënten kunnen worden gebruikt in cel-gebaseerde experimenten. Het uiteindelijke doel is om het moleculaire mechanisme van ultrasound actie te begrijpen, zodat de therapie kan worden verfijnd. In dit protocol gebruiken we muis embryonale fibroblasten (MEF) als een model mobiele systeem, maar echografie is ook gevonden effectief te zijn in primaire menselijke voorhuid fibroblasten 5, mesenchymale stamcellen, osteoblasten en chondrocyten 6. We gebruiken Rac1 activering voorbeeld biochemische assay, maar de werkwijze kan worden gebruikt zowel voor regeling van eiwitfosforylering of vorming van eiwit-complexen door immunoprecipitatie testen. Voor de immunofluorescentie voorbeeld tonen we een effect ultrageluid op focal adhesion vorming, maar herverdeling van elk molecuul kunnen worden onderzocht. Zo kon men de aanwerving van cytosolische factoren te toetsen aan de plasmamembraan, colocalisation van proteins in de handel blaasjes of onderzoeken van het effect van ultrageluid op mitotische spindel organisatie. Tot nu toe hebben we ons beperkt tot fibronectine afhankelijke trajecten testen door de werking van ultrageluid op cellen op collageen, of in aanwezigheid van groeifactoren kunnen worden getest het opbouwen van een beeld van ultrageluid invloed celgedrag in een complexe omgeving meer veel lijkt op een in vivo situatie. Een grotere uitdaging zal zijn om het effect van ultrageluid met behulp van time-lapse imaging, waar de aanwezigheid van de zender het lichtpad en trillingen het blokkeren van de echografie huidige aanvullende technische obstakels te testen. Echter, het feit dat de therapeutische toepassing op slechts 20 minuten van de stimulatie per dag in beslag suggereert dat analyse van cel gedrag na een uitbarsting van stimulatie kan ook productief te zijn.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust subsidie 088.419 aan MDB en sponsoring door Smith & Nephew Verenigd Koninkrijk Ltd
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |