Ce protocole décrit la stimulation des fibroblastes cultivés avec de faible intensité ultrasons pulsés, qui entraîne la formation d'adhésion focale et Rac1 activation en imitant l'engagement du récepteur transmembranaire matrice, le syndécane-4. Cette approche permet d'étudier une technique clinique réussie au niveau cellulaire, offrant ainsi des possibilités de raffinement de la thérapie.
Dans les organismes multicellulaires, le comportement des cellules est dictée par des interactions avec la matrice extracellulaire. Conséquences de la matrice de l'engagement du large de la réglementation de la migration et la prolifération cellulaire, la sécrétion d'une différenciation et même. Les signaux sous-tendant chacun de ces processus complexes proviennent des interactions moléculaires de la matrice extracellulaire des récepteurs sur la surface de la cellule. Les intégrines sont des récepteurs prototypes et de fournir un lien mécanique entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette, ainsi que de lancer certaines de les cascades de signalisation dépendantes de l'adhérence. Cependant, il est de plus en plus évident que d'autres récepteurs transmembranaires fonctionner en parallèle avec les intégrines de réglementer tant l'intégrine elle-même et des signaux en aval. Le plus élégant de ces exemples est le protéoglycane transmembranaire, le syndécane-4, qui coopère avec α β 1-5 au cours de l'intégrine adhérence à la fibronectine. Dans les modèles in vivo demonstrmangé l'importance de syndécan-4 de signalisation, comme syndécane-4-souris déficientes en protéine présentent un retard de guérison due à la migration des fibroblastes 1,2 inefficace. En animaux de type sauvage, la migration des fibroblastes vers une plaie est déclenchée par l'apparition de la fibronectine que les fuites de capillaires endommagés et est déposé par les macrophages dans le tissu lésé. Par conséquent, il ya un grand intérêt à découvrir des stratégies qui améliorent la fibronectine-dépendantes de signalisation et pourrait accélérer le processus de réparation.
Les composants de l'intégrine-médiées et syndécane-4-médiée de fibronectine-dépendantes de signalisation peuvent être séparés par des cellules de stimulation avec des fragments de fibronectine recombinant. Bien que l'engagement de l'intégrine est essentielle pour l'adhésion cellulaire, la fibronectine certains signaux dépendants sont réglementés par le syndécane-4. Syndecan-4 active le signal de Rac1 propulsion 3, provoque une redistribution des intégrines 1, déclencheurs de recrutement de molécules du cytosquelette, tels que la vinculine, à focaleadhérences 4, et induit de ce fait 3 la migration directionnelle. Nous avons examiné des stratégies alternatives pour l'activation de ces signaux et a constaté que de faible intensité ultrasons pulsés (LIPUS) peuvent mimer les effets de syndécane-4 l'engagement 5. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle 30 mW / cm 2, 1,5 échographie MHz, pulsé à 1 kHz (Fig. 1) peut être appliquée à des fibroblastes en culture (Fig. 2) pour induire l'activation de Rac1 et la formation d'adhésion focale. La stimulation ultrasons est appliquée pour une durée maximale de 20 minutes, comme cette combinaison de paramètres a été jugée la plus efficace pour l'accélération de la réparation d'une fracture clinique 6. La méthode utilise des fragments de fibronectine recombinantes à s'engager α 5 β 1-intégrine, sans engagement de syndécane-4, et requiert l'inhibition de la synthèse protéique par la cycloheximide à bloquer le dépôt de matrice supplémentaire par les fibroblastes., L'effet positif oéchographie f sur les mécanismes de réparation est bien documenté 7,8, et par la compréhension de l'effet moléculaire de l'échographie dans la culture que nous devrions être en mesure d'affiner la technique thérapeutique pour améliorer les résultats cliniques.
Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle un traitement qui est normalement appliqué à des patients humains peut être utilisé dans la cellule à base d'expériences. Le but ultime est de comprendre le mécanisme moléculaire d'action des ultrasons afin que la thérapie peut être affinée. Dans ce protocole, nous utilisons fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) comme un système cellulaire modèle, mais l'échographie a été également été trouvé pour être efficace dans des fibroblastes primaires de prépuce humain 5, les cellules souches mésenchymateuses, les ostéoblastes et les chondrocytes 6. Nous utilisons Rac1 activation comme un test biochimique par exemple, mais la méthode pourrait être utilisée aussi pour tester la réglementation de la phosphorylation de protéines ou la formation de complexes protéiques par immunoprécipitation. Pour l'exemple par immunofluorescence, nous démontrons une échographie effet sur la formation d'adhésion focale, mais la redistribution de toute molécule pourrait être examinée. Par exemple, on peut tester le recrutement de facteurs cytosoliques à la membrane plasmique, colocalisation de proteins dans des vésicules de trafic ou d'examiner l'effet des ultrasons sur l'organisation du fuseau mitotique. Jusqu'à présent, nous avons limité nous de tester la fibronectine voies dépendantes, par l'effet des ultrasons sur les cellules de collagène, ou en présence de facteurs de croissance pourrait être testé afin de dresser un tableau de la façon dont l'échographie affecte le comportement des cellules dans un environnement complexe que plus ressemble à une situation in vivo. Un plus grand défi consistera à tester l'effet des ultrasons à l'aide imagerie time-lapse, où la présence de l'émetteur qui bloque le chemin de lumière et les vibrations des ultrasons supplémentaires présents obstacles techniques. Cependant, le fait que l'application thérapeutique nécessite seulement 20 minutes de stimulation par jour suggère que l'analyse du comportement des cellules après une salve de stimulation pourrait bien être productif.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust 088419 subvention pour MDB et le parrainage par Smith & Nephew UK Ltd
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |