פרוטוקול זה מתאר את הגירוי של fibroblasts בתרבית עם אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה פעמו, המניע ליצירת מוקדי הידבקות ו Rac1 ההפעלה על ידי חיקוי האירוסין של הקולטן הטרנסממברני מטריקס, syndecan-4. גישה זו מאפשרת חקירה של טכניקה קליני מוצלח ברמה התאית, ובכך לספק הזדמנויות עידון של טיפול.
באורגניזמים תאיים, התנהגות התא מוכתב על ידי אינטראקציות עם תאי המטריצה. התוצאות של מטריקס מגוון, מעורבות של רגולציה של נדידת תאים ו ההפצה, על הפרשה ואף בידול. את האותות שבבסיס כל אלה תהליכים מורכבים נובעים אינטראקציות מולקולריות של קולטני תאי מטריקס על פני השטח של התא. Integrins הם קולטנים prototypic ולספק קישור מכני בין תאי מטריקס ו cytoskeleton, כמו גם ליזום כמה הידבקות תלויי מפלי איתות. עם זאת, זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי הקולטנים הטרנסממברני נוספים לתפקד לצד integrins את להסדיר הן את עצמו integrin אותות במורד הזרם. האלגנטי ביותר של דוגמאות אלה היא proteoglycan הטרנסממברני, syndecan-4, אשר משתפת פעולה עם β 5 α 1-integrin במהלך הדבקה על fibronectin. במודלים ב vivo demonstrאכלו את החשיבות של syndecan-4 איתות, כמו syndecan-4-בנוקאאוט עכברים להפגין פיגור ריפוי עקב 1,2 פיברובלסטים יעיל ההגירה. ב wild-type בעלי חיים, נדידת fibroblasts כלפי הפצע מופעלת על ידי הופעתו של fibronectin כי ההדלפות נימים פגומים מופקד על ידי מקרופאגים ברקמה הפגועה. לכן יש עניין רב לגלות אסטרטגיות המשפרות fibronectin תלויי איתות יכול להאיץ את תהליכי התיקון.
הרכיבים integrin בתיווך syndecan ו-4-בתיווך של fibronectin תלויי איתות יכול להיות מופרדים על ידי תאים מגרה עם שברי fibronectin רקומביננטי. למרות מעורבות integrin חיוני הידבקות התא, fibronectin מסוימים תלויי אותות מוסדרים syndecan-4. Syndecan-4 מפעיל את האות Rac1 ובולטות 3, גורם integrin חלוקה מחדש 1, מפעילה גיוס של מולקולות cytoskeletal, כגון vinculin, אל מוקדהידבקויות 4, ובכך גורם 3 כיווני ההגירה. בחנו את אסטרטגיות חלופיות עבור הפעלת אותות כאלה ומצא כי בעוצמה נמוכה אולטרסאונד פעמו (LIPUS) יכולים לחקות את ההשפעות של מעורבות-4 syndecan 5. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיטה שבאמצעותה 30 mW / cm 2, 1.5 אולטרסאונד MHz, פעמו ב kHz 1 (איור 1) ניתן ליישם fibroblasts בתרבות (איור 2) לגרום Rac1 הפעלה היווצרות מוקדי הידבקות. גירוי אולטראסאונד מוחל לכל היותר 20 דקות, כי זה שילוב של פרמטרים כבר נמצא להיות יעיל ביותר עבור האצת תיקון שבר קליני 6. השיטה משתמשת שברי fibronectin רקומביננטי לעסוק α β 5 1-integrin, ללא מעורבות של syndecan-4, והוא דורש עיכוב של סינתזת החלבון על ידי cycloheximide לחסום בתצהיר של מטריקס נוספת של fibroblasts ועוד, השפעה חיובית Oאולטרסאונד אישה על מנגנוני התיקון מתועדת היטב 7,8, ועל ידי הבנת ההשפעה המולקולרי של אולטרסאונד בתרבות אנחנו צריכים להיות מסוגלים לשפר את הטכניקה הטיפולית כדי לשפר את התוצאות הקליניות.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את שיטת הטיפול שחל בדרך כלל בבני אדם ניתן להשתמש בתא מבוססי ניסויים. המטרה הסופית היא להבין את המנגנון המולקולרי של פעולת אולטרסאונד, כך הטיפול יכול להיות מעודן. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) כמערכת מודל התא, אך אולטרסאונד כבר גם נמצא כיעיל העיקריים fibroblasts העורלה האדם 5, בתאי גזע mesenchymal, osteoblasts ו chondrocytes 6. אנו משתמשים Rac1 ההפעלה כמו assay למשל ביוכימי, אך השיטה יכולה לשמש באותה מידה לבחון רגולציה של זירחון חלבונים או היווצרות של קומפלקסים חלבונים על ידי immunoprecipitation. לדוגמה immunofluorescent אנחנו מדגימים אולטרסאונד משפיעים על היווצרות מוקדי הידבקות, אך חלוקה מחדש של מולקולת כל יכול להיבחן. לדוגמה, אפשר לבחון גיוס של גורמים cytosolic קרום פלזמה, colocalisation של proteתוספות ב שלפוחית סחר או לבחון את ההשפעה של אולטרסאונד על הארגון ציר mitotic. עד כה יש לנו את עצמנו מוגבלים לבדיקת fibronectin תלויי המסלולים, על ידי ההשפעה של אולטרסאונד על תאים על קולגן, או בנוכחות גורמי גדילה יכול להיבדק על מנת לבנות תמונה של איך אולטרסאונד משפיע על התנהגות התא בסביבה מורכבת יותר דומה למצב in vivo. אתגר גדול יותר יהיה לבחון את ההשפעה של אולטרסאונד באמצעות זמן לשגות הדמיה, שם הנוכחות של פולט חוסם את נתיב האור תנודות מן המכשולים אולטרסאונד הנוכחי טכניים נוספים. עם זאת, העובדה כי יישום טיפולי דורש רק 20 דקות של גירוי ליום עולה כי ניתוח של התנהגות התא לאחר פרץ של גירוי עשויים להיות יעילים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי Wellcome Trust מענק 088,419 ל MDB וחסות של Smith & Nephew באנגליה בע"מ
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |