Questo protocollo descrive la stimolazione dei fibroblasti in coltura a bassa intensità ultrasuoni pulsato, che guida la formazione di adesione focale e Rac1 attivazione imitando l'impegno del recettore transmembrana matrice, Syndecan-4. Questo approccio consente di indagine di una tecnica di successo clinico a livello cellulare, fornendo così opportunità per la raffinazione della terapia.
In organismi multicellulari, il comportamento cellulare è dettata dalle interazioni con la matrice extracellulare. Conseguenze della matrice impegno vanno dalla regolazione della migrazione e proliferazione cellulare, alla secrezione e anche la differenziazione. I segnali base di ciascuno di questi processi complessi derivano dalle interazioni molecolari di recettori della matrice extracellulare sulla superficie della cellula. Le integrine sono i recettori prototipici e fornire un collegamento meccanico tra la matrice extracellulare e il citoscheletro, nonché avviare alcune delle cascate di segnalazione adesione-dipendenti. Tuttavia, è sempre più evidente che recettori transmembrana aggiuntivi operato lungo le integrine di regolare sia la stessa integrina e segnali a valle. La più elegante di questi esempi è il proteoglicano transmembrana, Syndecan-4, che coopera con 5 α β 1-integrina durante l'adesione alla fibronectina. Modelli in vivo demonstrmangiò l'importanza della segnalazione Syndecan-4, come Syndecan-4-topi knockout presentano ritardo di guarigione a causa di 1,2 inefficiente la migrazione dei fibroblasti. In animali di tipo selvatico, la migrazione di fibroblasti verso una ferita viene attivato dalla comparsa di fibronectina che fuoriesce da danneggiato capillari e viene depositato mediante macrofagi nel tessuto danneggiato. Quindi c'è grande interesse per scoprire le strategie che aumentano fibronectina-dipendenti di segnalazione e potrebbe accelerare i processi di riparazione.
I componenti integrina-mediati e Syndecan-4-mediata di fibronectina-dipendenti segnalazione possono essere separate da stimolando le cellule con frammenti di fibronectina ricombinanti. Anche se l'impegno integrina è essenziale per l'adesione cellulare, fibronectina alcuni segnali dipendenti sono regolate da Syndecan-4. Syndecan-4 attiva il segnale di Rac1 protrusiva 3, provoca integrina redistribuzione 1, trigger reclutamento di molecole del citoscheletro, come vinculin, di focale4 adesioni, e induce così 3 direzionale di migrazione. Abbiamo cercato strategie alternative per l'attivazione di tali segnali e ha scoperto che a bassa intensità ultrasuoni pulsato (LIPUS) in grado di simulare gli effetti di Syndecan-4 di fidanzamento 5. In questo protocollo si descrive il metodo di 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultrasuoni, impulsi a 1 kHz (Fig. 1) può essere applicato a fibroblasti in coltura (Fig. 2) per indurre Rac1 attivazione e la formazione di adesione focale. Stimolazione ad ultrasuoni viene applicato per un massimo di 20 minuti, in quanto questa combinazione dei parametri è stato trovato per essere più efficace per l'accelerazione di riparazione delle fratture clinica 6. Il metodo utilizza frammenti di fibronectina ricombinanti per impegnare 5 α β 1-integrina, senza impegno di Syndecan-4, e richiede l'inibizione della sintesi proteica cicloeximide per bloccare deposizione di matrice supplementare dai fibroblasti., L'effetto positivo of ultrasuoni sui meccanismi di riparazione è ben documentata 7,8, e per comprendere l'effetto molecolare degli ultrasuoni nella cultura dovremmo essere in grado di affinare la tecnica terapeutica per migliorare gli esiti clinici.
In questo protocollo è descritto il metodo con cui un trattamento che viene normalmente applicato a pazienti umani possono essere utilizzati in esperimenti basati su celle. L'obiettivo finale è quello di comprendere il meccanismo molecolare di azione degli ultrasuoni in modo che la terapia può essere raffinato. In questo protocollo, si usa fibroblasti embrionali di topo (MEF) come sistema modello di cella, ma ad ultrasuoni è stato anche stato trovato per essere efficace in fibroblasti primari umani prepuzio 5, cellule staminali mesenchimali, osteoblasti e condrociti 6. Usiamo Rac1 attivazione come un saggio biochimico esempio, ma il metodo può essere utilizzato anche per testare regolazione di fosforilazione proteica o la formazione di complessi proteici di immunoprecipitazione. Per l'esempio immunofluorescenza si dimostra una ecografia effetto sulla formazione di adesione focale, ma la ridistribuzione di qualsiasi molecola potrebbe essere esaminato. Ad esempio, si potrebbe verificare assunzione di fattori citosolici alla membrana plasmatica, colocalisation di proteins in vescicole traffico o esaminare l'effetto degli ultrasuoni sull'organizzazione mitotico mandrino. Finora ci siamo limitati a noi stessi di test della fibronectina dipendenti percorsi, per effetto degli ultrasuoni sulle cellule sul collagene, o in presenza di fattori di crescita potrebbe essere testato per costruire un quadro di come gli ultrasuoni influenza il comportamento delle cellule in un ambiente complesso che più assomiglia una situazione in vivo. Una sfida maggiore sarà per testare l'effetto di ultrasuoni utilizzando time-lapse imaging, dove la presenza di emettitore bloccare il percorso di luce e vibrazioni dagli attuali ultrasuoni ulteriori ostacoli tecnici. Tuttavia, il fatto che l'applicazione terapeutica richiede solo 20 minuti di stimolazione al giorno suggerisce che l'analisi del comportamento delle cellule dopo un burst di stimolazione può anche essere produttiva.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal Wellcome Trust concessione 088.419 a MDB e la sponsorizzazione da parte di Smith & Nephew UK Ltd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |