Этот протокол описывает стимуляции культуре фибробластов с низкой интенсивностью импульсного ультразвука, который управляет координационный спаек и Rac1 активации, имитируя участие рецепторов трансмембранного матрицы, syndecan-4. Такой подход позволяет исследовать успешные клинические техники на клеточном уровне, обеспечивая тем самым возможности для уточнения терапии.
In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with α5β1-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.
The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal3, causes integrin redistribution1, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions4, and thereby induces directional migration3. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement5. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm2, 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair6. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage α5β1-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.
В этом протоколе описываются способ, которым лечение, которое обычно применяется для человека пациенты могут быть использованы в клеточных экспериментов. Конечная цель заключается в понимании молекулярного механизма действия ультразвука, так что лечение может быть уточнена. В этом протоколе, мы используем мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) как систему ячейка модели, но ультразвук был также признан эффективным в первичных человеческих фибробластов крайней плоти 5, мезенхимальные стволовые клетки, остеобласты и хондроциты 6. Мы используем Rac1 активации, например, биохимический анализ, но метод может быть использован в равной степени для проверки регулировании фосфорилирования белка или образование белковых комплексов по иммунопреципитации. Для иммунофлуоресцентного примере продемонстрировать влияние ультразвука на координационных спаек, но перераспределение любая молекула может быть рассмотрена. Например, можно проверить набор цитозольного факторов плазматической мембраны, colocalisation из proteмодулей в торговле пузырьки или изучения влияния ультразвука на митотический организации шпинделя. До сих пор мы ограничивались тестирование фибронектина зависит от пути, под действием ультразвука на клетки на коллаген, или в присутствии факторов роста могут быть проверены создать картину того, как ультразвук влияет на поведение клеток в сложных условиях, что более напоминает ситуацию в естественных условиях. Более сложной задачей будет проверить влияние ультразвука использованием покадровой обработки изображений, где присутствие эмитента блокирует путь света и вибраций от ультразвукового настоящее время дополнительные технические трудности. Тем не менее, тот факт, что терапевтическое применение требует только 20 минут в день стимуляция предполагает, что анализ поведения клеток после взрыва стимуляция может быть продуктивным.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Wellcome Trust грант в 088 419 МБР и спонсорство Smith & Nephew Великобритании ООО
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |