Detta protokoll beskriver stimulering av odlade fibroblaster med låg intensitet pulserande ultraljud, som driver fokal adhesion bildning och RAC1 aktivering genom att härma ingrepp transmembrana matrisen receptorn, syndekan-4. Detta tillvägagångssätt gör undersökning av en framgångsrik klinisk teknik på cellnivå, vilket ger möjligheter till förbättring av behandlingen.
I multicellulära organismer, är cellbeteende dikteras av interaktioner med den extracellulära matrisen. Konsekvenserna av matris-ingrepp sträcker sig från regleringen av cell-migration och-proliferation, utsöndring och även differentiering. Signalerna ligger var och en av dessa komplexa processer uppstå från de molekylära interaktioner av extracellulära matrix-receptorer på ytan av cellen. Integriner är den prototypiska receptorer och ger en mekanisk koppling mellan extracellulär matrix och cytoskelettet, såväl som att initiera en del av de adhesionsberoende signalkaskader. Emellertid har det blivit alltmer uppenbart att ytterligare transmembranreceptorer fungera parallellt med de integriner att reglera både den integrin självt och signaler nedströms. Den mest eleganta av dessa exempel är den transmembrana proteoglykan, syndekan-4, som samarbetar med α 5 β 1-integrin under vidhäftning till fibronektin. In vivo-modeller demonstratöreråt vikten av syndekan-4 signalering, som syndekan-4-knockoutmöss uppvisar healing retardation på grund av ineffektiv fibroblast migration 1,2. I vildtyp djur är migration av fibroblaster mot ett sår triggas av förekomsten av fibronektin som läcker från skadade blodkärl och avsattes genom makrofager i skadad vävnad. Därför finns ett stort intresse för att upptäcka strategier som förbättrar fibronektin-beroende signalering och kan påskynda reparationsprocesser.
Integrin-medierade och syndekan-4-medierad komponenterna i fibronektin-beroende signalering kan separeras genom att stimulera celler med rekombinanta fibronektinfragment. Även integrin engagemang är avgörande för cell adhesion, vissa fibronektin-beroende signaler regleras av syndekan-4. Syndekan-4 aktiverar RAC1 utskjutande signalen 3, orsakar integrin omfördelning 1, utlösare rekrytering av cytoskelett-molekyler, såsom vinkulin, till fokalsammanväxningar 4, och därmed inducerar riktad migration 3. Vi har sökt alternativa strategier för att aktivera sådana signaler och fann att låg intensitet pulserande ultraljud (LIPUS) kan efterlikna effekterna av syndekan-4 engagemang 5. I detta protokoll beskriver vi den metod med vilken 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultraljud, pulserades vid 1 kHz (fig. 1) kan appliceras på fibroblaster i kultur (fig. 2) för att inducera RAC1 aktivering och fokal adhesion formation. Ultraljud stimulering tillämpas för högst 20 minuter, eftersom denna kombination av parametrar har visat sig vara mest effektiva för acceleration av kliniska frakturer reparation 6. Metoden använder rekombinanta fibronektinfragment att ingripa med α 5 β 1-integrin, utan ingrepp av syndekan-4, och kräver hämning av proteinsyntes genom cykloheximid för att blockera avsättning av ytterligare matris av fibroblasterna., Den positiva effekten of ultraljud reparationsmekanismer är väl dokumenterat 7,8 och genom att förstå den molekylära effekten av ultraljud i kultur vi ska kunna förbättra den terapeutiska tekniken för att förbättra de kliniska resultaten.
I detta protokoll beskriver vi den metod med vilken en behandling, som normalt appliceras på humana patienter kan användas i cellbaserade försök. Det slutliga målet är att förstå den molekylära mekanismen för ultraljud åtgärder så att den behandlingen kan förfinas. I detta protokoll använder vi mus embryonala fibroblaster (MEF) som modell cellsystem, men ultraljud har också visat sig vara effektiva i primära humana förhudsfibroblaster 5, mesenkymala stamceller, osteoblaster och kondrocyter 6. Vi använder RAC1 aktivering som exempel biokemisk analys, men den metod skulle kunna användas på samma sätt för testa reglering av proteinfosforylering eller bildning av protein-komplex genom immunoutfällning. För immunofluorescens exemplet visar vi en effekt ultraljud fokus adherensbildning, men omfördelning av vilken molekyl som helst kan undersökas. Exempelvis kan man testa rekrytering av cytosoliska faktorer till plasmamembranet, colocalisation av proteprogram i människohandel blåsor eller undersöka effekten av ultraljud på mitotisk spindel organisation. Hittills har vi begränsat oss till att testa fibronektin-beroende vägar, genom effekten av ultraljud på celler på kollagen, eller i närvaro av tillväxtfaktorer kan testas för att bygga upp en bild av hur ultraljud påverkar cellens beteende i en komplex miljö som mer liknar en in vivo-situationen. En större utmaning blir att testa effekten av ultraljud att använda time-lapse avbildning, där närvaron av sändaren blockerar ljuset vägen och vibrationer från ultraljud nuvarande ytterligare tekniska hinder. Tyder dock på det faktum att terapeutiska applikationen kräver bara 20 minuter stimulering per dag som analysen av cellens beteende efter en skur av stimulering kan mycket väl vara produktiv.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Wellcome Trust bidrag 088.419 till MDB och sponsring av Smith & Nephew Storbritannien Ltd
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |