Bu protokol, fokal adezyon oluşumu ve transmembran reseptör matrisi, syndecan-4 nişan taklit ederek Rac1 aktivasyon sürücüler düşük yoğunlukta kesikli ultrason ile kültüre fibroblast stimülasyonu açıklar. Bu yaklaşım, böylece tedavinin arıtma için fırsatlar sağlayarak, hücresel düzeyde başarılı bir klinik tekniğin soruşturma sağlar.
Çok hücreli organizmalarda, hücrenin davranış hücre dışı matriks ile etkileşimi tarafından dikte edilir. Hücre migrasyonu ve proliferasyonu düzenlenmesinden, sekresyon ve hatta farklılaşma matriks-nişan aralığı Sonuçları. Bu, karmaşık işlemlerin her yatan sinyalleri hücrenin yüzeyi üzerinde hücre dışı matris reseptörlerinin moleküler etkileşimin ortaya çıkar. İntegrinler prototipik reseptörleri ve mekanik bir hücre dışı matris ve hücre iskeleti arasındaki bağlantı, hem de yapışma bağımlı bir sinyalleşme cascades bazı başlatıcı sağlamaktır. Ancak, ek transmembran reseptörleri aşağı integrin kendisi ve sinyallerini düzenleyen integrinler yanında çalışmasını giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bu örneklerden en zarif fibronektine adezyonu sırasında α 5 β 1-integrin ile işbirliği transmembran proteoglikan, syndecan-4 vardır. In vivo modellerde demonstrsyndecan-4-yoksun farelerde verimsiz fibroblast göçü 1,2 nedeniyle şifa geriliği sergilemek gibi, syndecan-4 sinyal önemini yedik. Vahşi tip hayvanlar, bir yara doğru fibroblastların göçü hasarlı kılcal damarlardan sızıntı ve yaralı dokularda makrofajlar tarafından yatırıldığına dair fibronektin görünümünü tarafından tetiklenir. Bu nedenle fibronektin bağımlı sinyal geliştirmek ve onarım işlemleri hızlandırabilir stratejileri keşfetmek büyük ilgi var.
Fibronektin bağlı sinyal integrin-aracılı ve syndecan-4-aracılı bileşenleri rekombinant fibronektin parçaları ile birlikte uyaran hücreleri tarafından ayrılabilir. Integrin angajman hücre yapışması için gerekli olmasına rağmen, belirli fibronektin-bağımlı sinyallerden syndecan-4 düzenlenir. Syndecan-4 etkinleştirir Rac1 çıkıntılı sinyali 3, fokal integrin dağıtılması 1 gibi vinculin gibi hücre iskeleti moleküllerinin tetikler işe alım, nedenadezyon 4, ve böylece yönsel göçü 3 indüklemektedir. Biz bu sinyalleri aktive etmek için alternatif stratejiler için baktım ve düşük yoğunlukta kesikli ultrason (LIPUS) syndecan-4 nişan 5 etkilerini taklit bulduk. Bu protokolü biz 1 kHz (Şekil 1) darbeli 30 mW / cm 2, 1.5 MHz ultrason, Rac1 aktivasyonu ve fokal adezyon oluşumunu uyarmak için kültür fibroblastlar (Şekil 2) uygulanabilir hangi yöntemi açıklar. Bu parametrelerin kombinasyonu klinik kemik onarımı 6 hızlandırılması için en etkili olduğu tespit edilmiştir olarak ultrason uyarılması, 20 dakikalık bir süre için uygulanır. Yöntemi syndecan-4 angajman olmadan α 5 β 1-integrin, meşgul rekombinant fibronektin parçaları kullanır ve fibroblastlar tarafından ek matriks birikimi engellemek için sikloheksimid protein sentezini inhibe gerektirir., Olumlu etkisi otamir mekanizmaları f ultrason de 7,8 belgelendi, kültür ve ultrason moleküler etkisi anlayarak biz klinik sonuçları iyileştirmek için tedavi tekniği geliştirmek gerekir.
Bu protokolde, normalde insan hastalara uygulanan bir tedaviye hücresi bazlı Deneylerde kullanılan edilmesini sağlayacak yöntemi açıklanmaktadır. Nihai hedefi tedavisi rafine böylece ultrason eylem moleküler mekanizması anlamaktır. Bu protokol, biz bir model hücre sistemi olarak fare embriyonik fibroblast (MEFS) kullanır, ancak ultrason da birincil insan sünnet derisi fibroblastlarında 5, mezenkimal kök hücre, osteoblast ve kondrosit 6 etkili olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. Bir örnek olarak test biyokimyasal Rac1 aktivasyon kullanan, ancak aynı derecede protein yöntemi fosforilasyon ya immünopresipitasyon protein kompleksleri oluşumu düzenlemesi test etmek için kullanılabilir. Immünofloresan Örneğin biz fokal adezyon oluşumu üzerine etkisi ultrason gösteren, ancak herhangi bir molekül dağılımının yeniden incelenebilir. Örneğin, bir prote arasında colocalisation, plazma zarına sitosolik faktörlerin alım test edebilirkaçakçılığı veziküllerde bileşenlerini veya mitotik iğ organizasyon ultrason etkilerini incelemek. Şimdiye kadar kendimizi kollajen üzerine, ya da büyüme faktörleri varlığında ultrason karmaşık bir ortamda hücre davranışlarını nasıl etkilediği konusunda bir resim oluşturmak için test edilebilir hücreleri üzerinde ultrason etkisi ile, fibronektin-bağımlı yolların test sınırlı olduğunu daha yakından bir in vivo durum benzer. Daha büyük bir zorluk verici varlığı ultrason Mevcut ek teknik engeller ışık yolu ve titreşim engelleme time-lapse görüntüleme, ultrason kullanarak etkisini test etmek olacaktır. Ancak, tedavi uygulaması günlük stimülasyon sadece 20 dakika gerektirdiği gerçeğine stimülasyon bir patlama sonrası hücre davranışı o analizi de verimli olabileceğini düşündürmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Smith & Nephew Birleşik Krallık Ltd MDB ve sponsorluk için Wellcome Trust hibe 088.419 tarafından desteklenmiştir
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |