Summary
여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.
Abstract
소장 내에서 concomitantly 남아 침입 병원균의 1,2으로 염증 반응을 마운트 태세를하면서 공생 식물 및 식품 항원으로 허용 오차를 추진에 관여하고 타고난 및 적응 면역 세포의 독특한 인구 거주. 항원 제시 세포, 특히 DCS 및 macrophages은 감각 능력을 통해 장내 면역 항상성을 유지하는 중요한 역할을 적절하게 microbiota 3-14에 대응. 창자 DCS 및 macrophages의 효율적인 분리는 이러한 세포의 표현형 및 기능을 특성화의 중요한 단계입니다. DCS 및 macrophages를 포함한 장내 면역 세포를, 분리 많은 효과적인 방법은 6,10,15-24 설명되어 있지만, 많은 사람들이 부정적인 세포 표면 항원 발현, 세포 생존 및 / 또는 세포 수율에 영향을 미칠 수있다 긴 digestions 시간에 의존. viabl 다수의 신속한 격리를위한 여기서는 세부 방법론을E, 창자 DCS 및 macrophages. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성화 직접 멀티 컬러 흐름 cytometric 분석을위한 구체적인 형광 라벨이 표시된 단클론 항체와 격리된 창자 세포를 더럽히는 것에 의해 수행됩니다. 또한, 매우 순수 DC 및 대식 세포의 인구는 셀 정렬 뒤에 CD11c 및 CD11b 자기가 활성화된 세포 분류 구슬을 이용한 기능성 연구에 대해 격리됩니다.
Protocol
1. 해부와 창자 상피 세포의 분리
시약 및 장비의 준비 :
- 실온에 따뜻한 칼슘 2 + / MG 2 + 프리 PBS (CMF PBS).
- 5% FBS (CMF HBSS / FBS)와 실온에 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 따뜻한 칼슘 2 + / MG 2 + 무료 HBSS.
- 37까지 따뜻한 궤도 흔드는 ° C.
참고 : 1.7-1.1 단계는 세포 사망의 범위를 최소화하고 최대 세포 수율을 달성하기 위해 최대한 빨리 수행해야합니다.
- 복부 및 흉부 향해 CO 2 챔버 및 스프레이 70 % 에탄올에 쥐를 안락사시켜야.
- 가위와 다시 껍질 복막을 노출하기 위해 피부와 복부의 중간에 작은 수평 절개를합니다.
- pyloric 괄약근에서 절단하여 상부 소장에서 배를 분리 진행합니다. 집게와 장간막을 떨어져 애타게과에 다시 절단ileo-cecal 밸브가 대장에서 전체 소장을 풀고있다. 항문 직전에 상처를 만들고 대장은 무료이며 때까지 다시 장간막을 떨어져 애타게.
- 길이 방향 가위를 사용하여 콜론을 열고 잘라 실온에서 CMF PBS의 창자 루멘에서 배설물 내용과 점액을 씻어.
- macroscopically 작은 창자의 안티 mesenteric 표면을 따라 Peyer의 패치를 해부하고 길이 방향 작은 창자를 오픈 잘라 가위와 집게를 사용하십시오.
- 실온에서 CMF PBS의 지저분한 내용과 점액의 작은 창자의 루멘 씻으십시오.
- 별도로 사전 예열 CMF HBSS / FBS와 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 30 ML을 포함하는 별도의 50 ML 원뿔 튜브에 약 1.5 cm의 조각과 장소에 작은 / 큰 창자를 잘라. 50 ML 원뿔 튜브 당 1 이상 소장을 추가하지 마십시오.
- 수평 ° C. <37시 20 분 동안 궤도 흔드는로 각각 50 ML 원뿔 튜브를 삽입 및 250 rpm으로 위해 악수/ 리>
- 폐기물 양동이를 통해 하나의 메쉬 와이어 스트레이너를 삽입하고 소장의 1.5 cm 조각을 복구를 통해 각각 50 ML 원뿔 튜브의 내용을 부어 2로 미리 예열 CHBSS / FBS의 30 ML을 포함하는 별도의 50 ML 원뿔 튜브에 넣어 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산).
- 1.8 반복합니다.
2. 조직 소화와 창자 세포의 분리
시약 및 장비의 준비 :
- Collagenase 솔루션 : 1.5 MG / ML 타입 VIII Collagenase는 DNase 나의 40 μg / ML로 미리 예열 CMF HBSS / FBS에 녹아있는
- 사전 예열 CMF HBSS / FBS와 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산).
- 37 미리 예열 궤도 흔드는 ° C.
- 얼음처럼 차가운 CMF HBSS / FBS.
- 흔들림의 두 번째 라운드 후, 스트레이너를 통해 각각 50 ML 원뿔 튜브의 내용을 부어하고 작은 플라스틱으로 소장의 1.5 cm 조각을 전송 종이 타월을 사용하여 여분의 미디어를 멀리 dabbing 후 보트를 달다.
- 신속하게 1을 말하다소장의 0.5 cm 조각 체중 보트에 직접 가위를 사용하고 collagenase 용액의 20 ML에 다진 소장을 추가합니다. 가로 37에 10-20 분 동안 200 rpm으로 궤도 흔드는 및 다이제스트로 각각 50 ML 원뿔 튜브를 삽입 ° C.는 최적화에 관한 아래의 논의를 참조하십시오.
- 직접 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 언제 나머지 장 조직 및 필터의 철저한 분리를 보장 간략히 소용돌이.
- CMF HBSS / FBS 및 4에서 5 분 1,500 rpm으로 원심 ° C. 각각 50 ML 원뿔 튜브 톱 오프 고체 펠렛은 원심 분리 후 콜론 샘플에 대해 관찰되지 않을 경우 샘플은 3.5 분 동안 다시 centrifuged해야합니다. 한번 더이 세차 단계를 반복합니다.
- 뜨는을 붓고 얼음처럼 차가운 CMF HBSS / FBS 및 장소 샘플 얼음에 세포 펠렛을 resuspend.
- 고속 셀 sorti위한 자성-비드 농축을위한 FACS 수집 / 분석 또는 제 4 항 3으로 진행합니다NG.
3. DCS 및 Macrophages의 멀티 컬러 흐름 Cytometric 분석을위한 항체 염색법
시약 및 장비의 준비 :
- 얼음처럼 차가운 CMF PBS.
- 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼 (CMF PBS가 + 5퍼센트 FBS).
- 죽었 / LIVE 고칠수 아쿠아 죽은 세포 얼룩 키트를 사용하여 1:1000 희석에 얼음처럼 차가운 CMF PBS에 얼룩 죽은 세포를 준비합니다.
- CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA B) - 알렉사 형석 700 CD11b 다음 형광 라벨이 표시된 단클론 항체 (mAbs) 심심풀이 염색법 버퍼에 추가하여 항체 염색법 칵테일을 준비 - eFluor 450 F4/80-PE-Cy7.
- 5 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 (FACS) 튜브에 세포를 전송합니다.
- 얼음처럼 차가운 CMF PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 죽은 세포로 품어 샘플은 어두운 얼음 속에서 15 분 동안 얼룩.
- 얼음처럼 차가운 CMF PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 얼음처럼 차가운 염색법의 2.4G2 anti-FcγRIII/II있는 블록 세포얼음에 10 분 대한 버퍼.
- 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼에 세포를 씻으십시오.
- 어두운 얼음 속에서 20 분 대한 항체 염색법 칵테일과 샘플을 품어.
- 두번 심심풀이 염색법 버퍼로 세포를 씻어과 얼음처럼 차가운 염색법 완충액 400 μl에 샘플을 resuspend하고 FACS 튜브 40 μm의 필터 캡을 통과.
- 제 5 및 그림 1에 게이팅 전략에 의해 정의된대로 LSR II cytometer (BD)에 샘플을 습득.
4. 소장의 DCS 및 Macrophages의 농축
시약 및 장비의 준비 :
- 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼 (CMF PBS가 + 5퍼센트 FBS).
- 제조 업체의 지침에 따라 CD11b와 CD11c 맥에서 구슬있는 단계를 2.5에서 얻은 단일 세포 현탁액을 품어.
- 원심 분리에 의해 다음에 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼로 세포를 씻으십시오.
- 뜨는을 무시하고 1 ML 심심풀이 염색법 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend그리고 40 μm의 셀 스트레이너 다음에 100 μm의 셀 스트레이너 통과.
- 맥에서 LS 자기 컬럼을 이용하여 긍정적인 선택에 의해 자성 비드 연결된 세포에 대한 더욱 돋보이게합니다.
- 단계 4.2 반복하고 뜨는 버리고.
- 와 같은 단계를 3.7에서 설명한 표면 마커 mAbs과 세포를 품어.
- 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼로 두 번 마그네틱 비드 - 농축 세포를 씻으십시오. 나트륨 azide없이 500 μL 심심풀이 염색법 버퍼에 셀 알약을 Resuspend하고, FACS 튜브로 40 μm의 셀 스트레이너 통과.
- 창자 DC 및 / 또는 관심있는 대식 세포의 하위 집합을 정렬하는 BD ARIA II 세포 분류기에서 FACS-분류로 진행합니다.
5. LP APCs위한 게이팅 전략
참고 : 흠없는 창자 세포가 긍정과 부정 인구를 구분하기 위해 성문의 적절한 배치를 지원하기 위해 부정적인 제어로 활용됩니다 유의하시기 바랍니다.
- 그림에 나타난 바와 같이1 도트 계획을 작성하고 이중어 행사의 배제 (그림의 1B 및 C) 다음에 얼룩 죽은 세포 (그림 1A) 양성 반응 세포를 제외할 수 있습니다. 그런 다음, 전달 및 사이드 분산형는 (그림의 1D) 파편을 제외해야하기에 따라 관심의 세포에 게이트.
- CD45의 다른 점 줄거리와 더 게이트 만들기 +와 아이오와 B + phenotypically APCs (그림 1E)를 특징 세포.
- 별도의 도트 줄거리에서 CD11b 및 특정 DC 및 대식 세포의 하위 집합을 (.; 그림 1 층 R1, R2 및 R3) 구별하는 CD11c 표현에 대해 분석합니다. R1의 세포는 CD11c + CD11b입니다 / 무뎌 - 세포. 지역, R2는 이러한 세포가 R1의 세포와 같이 CD11c 위해 표면 표현의 유사한 수준을 가지고 있지만 R2의 세포도 급행 CD11b 그러한 delineated있다. - 이후 R3 지역은 CD11b +를 그리고 / 무딘 CD11c있는 세포를 위해 지정되어 있습니다.
- 지역 R1, R2, 그리고 대식 세포 및 DC 인구를 차별화하기 위해 R3 F4/80에 대한 그리고 CD103 표현, 각각을 alyze. CD11c + CD11b / 무딘 - αE 인테, CD103, 그리고 F4/80의 낮은 수준 (그림 1G)의 R1 명시적인 높은 수준의 세포. CD11b + CD11c + R2의 세포는 CD103과 F4/80 (그림 1H)들의 dichotomous 표현을 바탕으로 DCS 및 macrophages 모두 구성되어 있습니다. 마지막으로, CD11b + CD11c 무딘 / - R3의 세포가 F4/80 +와 CD103의 phenotypic 프로파일을 기반으로 macrophages를 구성 - (그림 1I) 16.
6. 대표 결과
1 그림. 창자 DCS 및 macrophages를위한 게이팅 전략. 죽은 세포 ()와 doublets (B와 C)은 첫번째 작은 intesti 다음 분석에서 제외하고 있었다nal 세포 전달 따라 게이트와 사이드 분산형 (D) 였는데, APCs는 CD45과 같이 정의되었다 + 아이오와 B + (E). Macrophages와 DC가이 CD11b와 CD11c (F)의 표현에 의해 확인되었다. CD103과 사전 문이 R1 (G), R2 (H)와 인구 (I) R3에서 전지 F4/80 식을 분석되었다.
그림 2. 세포 수율 및 항체 염색법 품질은 소화 시간에 따라 달라집니다. CD11b와 CD11c 염색법 패턴 이하 - (A, D)의 총 세포 수율, 최적 - (B, E) 또는 오버 소화는 (C, F) 장 조직.
창자 세포는 C57BL / 6 마우스 소장으로부터 격리되었고 DCS 및 macrophages는 BD LSR II에 FACS로 분석되었다. 전압 및 보상은 흠없는 및 단일 fluorochrome 묻은 splenocytes를 사용하여 설정되었다. 죽은 세포 (그림 1A) 및 doublets은 (그림의 1B 및 C) 처음부터 제외되었습니다분석. 관심있는 세포 그 다음 전달하고 따라 분석되었다 CD45에 게이팅 뒤에 사이드 분산형 (그림의 1D) + 및 IA B + 세포 (그림 1E). 이후 CD11b와 CD11c 표현은 CD45 사이에 평가되었다 + 아이오와 B 세 지역 (R1, R2 및 R3., 그림 1 층) 윤곽을 그리다하기 + 세포. 세 지역에서 CD103과 F4/80 표현은 각각 DCS 및 macrophages 구별 평가되었다. CD11c + CD11b 무딘 / - R1의 세포가 αE 인테, CD103, 그리고 F4/80의 낮은 수준 (그림 1G)의 높은 수준을 보였다. CD11b + CD11c + CD11b + CD11c / 무딘 동안 R2의 세포는 CD103과 F4/80 (그림 1H)들의 dichotomous 표현을 바탕으로 DCS 및 macrophages 모두 구성되어 있었다 - R3의 세포 F4 /의 phenotypic 프로파일을 기반으로 macrophages를 구성 80 +와 CD103 - (
총 세포 수율 및 CD11b와 CD11c의 표현에 대한 조직 소화 기간의 관계는 그림 2에 설명된됩니다. 3 분 (이하 - 소화)를 소화했다 장 조직은 낮은 총 휴대폰 번호 (그림 2D) 그래서 몇 DCS 및 특성에 사용할 수 macrophages (그림 2A)를 굴복. 11 분 용 티슈는 소화 CD11b와 CD11c 높은 수준을 표명하고 (그림 2C) phenotypically 독특했다 DCS 및 macrophages의 인구 라이브 셀 (그림의 2E)의 강력한 수확량을 생산했다. 대조적으로 50 분 (오버 소화)에 대한 소화가 유사한 세포 수율으로 이어지는 경우 공동최적 소화 (그림 2E와 F)에 mpared 그러나, CD11b와 CD11c를 사용하여 서로 다른 세포 집단의 묘사는 (그림 2C) CD11c 줄었의 표현으로 더 애매한되어 죽은 세포의 숫자 (데이터가 표시되지 않음) 증가했다.
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Discussion
그림 3. 세포 수율 및 표면 항원 표현의 최적화에 중요한 요인. 세포 수율 및 표면 항원 표현이 직접적으로 조직 소화 기간의 영향을받는, collagenase의 구체적인 특성, 닦지 조직의 정도와 염증의 유무, 이는 조직 무결성 및 cellularity 영향을 미칠 수 있습니다. 불충 분한 조직 소화가 분석을위한 세포의 소수가 발생할 수도 있지만 장기 조직 소화가 감소 세포 생존 능력과 표면 항원 발현을 초래할 수 있습니다.
여기서는 멀티 컬러 유동세포계측법를 사용 phenotypic 특성과 세포를 정화에 기능성 연구를 수행하도록 정렬 맥을 비즈와 세포를 사용하여 농축을위한 마우스 창자 DCS 및 macrophages의 급속한 분리에 대한 방법론을 상세하게. collagenase의 농도를 최적화및 조직 소화 기간은 생존과 표면 항원 발현을 손상시키지 않고 강력한 세포 수율을 생산하는 데 필요합니다. 아래 - 소화가 낮은 총 휴대폰 번호와 특성화를위한 DCS 및 macrophages의 소수 (그림 2A와 D)를 듭니다. 한편, 과잉 소화가 최적화된 조건과 비슷한 총 휴대폰 번호 (그림 2F)를 듭니다하지만, 죽은 세포의 수가 appreciably 증가하고 있습니다 (데이터가 표시되지 않음)과 염색법의 품질이 손상됩니다. 이하 - 소화와 마찬가지로, 조직의 과잉 소화 phenotypic 특성과 정화를 복잡하게합니다.
이 프로토콜을 사용하여 고려에 대한 몇 가지 추가 매개 변수는 제조 업체, 종류와 collagenase, 소장의 무결성과 cellularity의 특정 많은, 그리고 닦지 조직의 학위입니다. collagenase 활동의 변화는 다른 제조 업체, collagenase의 종류, 생산 이오 사이에 존재할 수 있기 때문에TS, 소화의 힘 크게 다를 및 최적화가 필요합니다. 따라서 collagenase의 가장 적합한 유형의 선택은 데이터의 품질과 재현성에 영향을 줄 수 있으므로 실험을 디자인할 때 중요합니다. 우리의 경험에서 시그마 - 올드 리치에서 얻은 collagenase 유형 VIII는 최상의 결과를 제공하지만, 우리는 또한 시그마 - 올드 리치에서 collagenase 유형 IV를 사용하여 성공을 이뤄 냈습니다.
위의 상세한 프로토콜 건강한 크고 작은 창자에 사용을 위해 최적화되어 있지만, 그것은 성공적으로 증가 cellularity과 염증과 관련된 건축 왜곡을 전시 염증 조직에서 DCS 및 macrophages의 분리에 사용될 수 있습니다. 창자 염증의 존재는 극적으로 소화 - 종종 우리의 경험을 바탕으로 proteolytic 효소의 작용으로 장 조직의 감도를 증가 속도에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 소화 또는 concentratio 기간collagenase의 N은 염증과 연관된 조직 무결성의 변화에 따라 적응해야합니다.
또한 닦지 조직의 정도는 조직 소화 기간에 영향을 미칩니다. 작은 조각으로 닦지 조직이 소화를 위해 표면적을 증가 시키며, 더 많은 세포를 얻을하지만 조직은 지나치게 소화에 더 감염될 수 있으므로 예방 차원에서, 촬영해야합니다. 따라서 소화의 기간은 감소해야 할 수도 있습니다. 반대로, 가난한 닦지이 저조한 낮은 총 세포 수율로 인한 소화 것입니다 조직의 더 큰 조각을 초래할 것입니다. 소화 기간을 늘리면 어느 정도로 가난한 닦지 보상 수도 있습니다.
collagenase와 장 조직의 소화 대한 매개 변수를 최적화되면 강력한 세포 수율을 빠르게 달성할 수 있습니다. 결과적으로 장내 DC 및 대식 세포의 인구는 더 정확하게 특성화 수 있으며 시토킨을 평가하기 위해 기능적인 공부를 정화생산, 항원 프레 젠 테이션, 그리고 면역 세포의 규제.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 셀 정렬을 위해 아론 레이를 (에모리 대학 소아과학과와 애틀랜타 흐름 코어의 어린이 건강 관리) 감사합니다. 이 작품은 TLD에 NIH 교부금 AA01787001, Crohn의 및 미국의 대장염 재단의 경력 개발 수상 및 에모리 - Egleston 아동 연구 센터 종자 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
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