Summary
Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen THP1
Abstract
Leishmaniasis is een van de meest verwaarloosde ziekten ter wereld, grotendeels die de armste van de armen, vooral in ontwikkelingslanden. Meer dan 350 miljoen mensen worden beschouwd als een risico van aanbestedende leishmaniasis, en ongeveer 2 miljoen nieuwe gevallen doen zich jaarlijks 1. Leishmania donovani is de verwekker van viscerale leishmaniasis (VL), de meest dodelijke vorm van de ziekte. De keuze van de medicijnen beschikbaar om leishmaniasis te behandelen is beperkt 2; huidige behandelingen bieden beperkte werkzaamheid en velen zijn giftig bij therapeutische doses. Bovendien hebben de meeste van de eerste lijn behandeling drugs al verloren hun bruikbaarheid door toenemende multiple drug resistance 3. De huidige pijplijn van anti-leishmanial drugs is ook sterk uitgedund. Aanhoudende inspanningen zijn nodig om een nieuwe anti-leishmanial drug discovery pijplijn te verrijken, en dit streven is gebaseerd op de beschikbaarheid van geschikte in vitro screening modellen.
In vitro promastigoten 4 en axenische amastigoten assays 5 worden voornamelijk gebruikt voor anti-leishmanial drug screening kan echter niet geschikt als gevolg van belangrijke cellulaire, fysiologische, biochemische en moleculaire verschillen in vergelijking met de intracellulaire amastigoten. Assays met macrofagen amastigoten modellen worden beschouwd dichtst bij de pathofysiologische omstandigheden van leishmaniasis en zijn daarom het meest geschikt voor in vitro screening. Gedifferentieerde, niet-delende humane acute monocytische leukemiecellen (THP1) (een aantrekkelijke) alternatief voor geïsoleerde primaire macrofagen en kan worden gebruikt voor het bepalen van anti-leishmanial activiteit van verschillende verbindingen tegen intracellulaire amastigoten.
Hier presenteren we een parasiet-rescue en transformatie test met gedifferentieerde THP1 cellen geïnfecteerd in vitro met Leishmania donovani voor het screenen van zuivere stoffen en natuurproducten prodducten extracten en het bepalen van de werkzaamheid tegen de intracellulaire Leishmania amastigoten. De bepaling omvat de volgende stappen: (1) differentiatie van cellen THP1 niet-delende macrofagen, (2) infectie van macrofagen met L. donovani promastigoten metacyclische, (3) behandeling van geïnfecteerde cellen met testgeneesmiddelen, (4) gecontroleerd lysis van geïnfecteerde macrofagen (5) release / redding van amastigoten en (6) verwerking van levende amastigoten te promastigoten. De assay werd geoptimaliseerd met detergent lysis gecontroleerde behandeling van Leishmania-geïnfecteerde cellen THP1 bijna volledige redding van levensvatbare intracellulaire amastigoten bereiken met minimale effecten op hun vermogen om te transformeren naar promastigoten. Verschillende macrofaag: promastigoten verhoudingen werden getest om de infectie bereiken. Kwantificering van de infectie werd uitgevoerd door middel van transformatie van levende, geredde Leishmania amastigoten om promastigoten en de evaluatie van hun groei door een alamarBlue fluorometrische assay in 96-well microtiterplaten. Deze test is vergelijkbaar met de momenteel gebruikte microscopische transgene reportergen en digitale beeldanalyse assays. Deze test is robuust en meet alleen de live intracellulaire amastigoten ten opzichte van reportergen en beeldanalyse assays, die niet kunnen onderscheid maken tussen levende en dode amastigoten. Ook is de assay gevalideerd met een huidige panel van anti-leishmanial drugs en is met succes toegepast op grootschalige screening van zuivere verbindingen en een bibliotheek van natuurlijke producten fracties (Tekwani et al.. Gepubliceerd).
Protocol
1. Onderhouden en Subculture THP1 Cultuur van de Cel
- Handhaven THP1 cellen in RPMI-1640 medium (met 10% FBS en pH 7,4) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Subcultuur cellen tweemaal per week cellen niet overschrijdt 1x10 6 cellen / ml. Dit is belangrijk om de transformatie vermogen.
2. Onderhouden en Subculture Leishmania donovani promastigoten Cultuur
- Handhaving van de L. donovani promastigoten (S1, sudan stam) in RPMI-1640 medium (zonder natriumbicarbonaat en natriumpyruvaat) met 10% FBS bij 26 ° C.
- Subculture L. donovani promastigoten twee keer per week, met de hoogste concentratie cellen in het bereik van 20-25x10 6 promastigoten / ml.Caution: Alle media en oplossingen moeten worden voorgelegd aan de kamertemperatuur vóór gebruik.
3. Zaaien en differentiatie van de THP1 cellen in een 96-well Microplate en 16-chamber Glazen Cultuur Dia.
- Bereid een verdunde THP1 cultuur met cellen van 2.5x10 5 cellen / ml van een vier dagen oude celkweek (cellen niet meer dan 10 6 cellen / ml) in RPMI-1640 met 10% door warmte geïnactiveerd FBS. Bereid 20 ml van de cultuur voor elke 96-well plaat en 4 ml van de cultuur voor elke 16-well kamer dia.
- Voeg forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (voor differentiatie van THP1) om verdunde celkweek suspensie (10 μl/20 ml cultuur van de stock van 50 ug / ml in DMSO) (uiteindelijke concentratie PMA in verdunde cellen cultuur worden 25 ng / ml).
- Om de Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test te vergelijken, het opzetten van de testen gelijktijdig in heldere, vlakke bodem, 96-well plaat en 16-kamer, glas, microscopische cultuur dia.
- Doseer 200 ul THP1-PMA-behandelde cellen in elk putje of kamer.
- Incubeer de 96-well plates en 16-well kamer slides in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende de nacht bijna volledige differentiatie van de cellen mogelijk.
Opmerking: De THP1 cellen, die normaal groeien in suspensie worden gedifferentieerd in hechtende macrofagen.
4. Infectie van de getransformeerde cellen THP1 met Leishmania donovani promastigoten
- Bij infecties van gedifferentieerde THP1 celkweek met Leishmania donovani promastigoten, moet de meerderheid van de parasieten in de besmettelijke metacyclische stadium (lange cilindrische vormen, ~ 5-6 dagen oude cultuur).
- Een 1:10 THP1 cel parasiet verhouding optimaal voor de infectie in zowel de Digital-Image-analyse-Direct-tel-Assay en de Promastigote-Rescue-Transformatie-Assay.
- Bereid een verdunde cultuur van L. donovani promastigoten met een parasiet telling van 2.5x10 6 parasiet / ml (voor THP1 cellen: parasieten ratio = 1:10) uiteen 5 tot 6 dagen oude cultuur in RPMI-1640 medium met 2% FBS.
- Uit stap 3.5 (na overnacht differentiatie van THP1 celkweek) nemen de platen en de kamer slides, verwijder het medium en een keer wassen celculturen met serumvrij RPMI-1640 medium.
- Na zorgvuldige wassen van PMA-behandelde cellen met THP1 serumvrij, warm RPMI-1640 (~ 37 ° C) medium, vervangen serumvrij medium met 200 pi van de verdunde kweek van L. donovani promastigoten (2.5x10 6 parasieten / ml) uit stap 4.3. Stel de controleputjes van THP1 cellen zonder de parasiet en de parasieten zonder THP1 cellen in elk bord en 16-well kamer dia's.
- Na toevoeging van de parasiet THP1 celkweek, de plaat en dia incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur om de parasieten de gedifferentieerde THP1-cellen te infecteren.
5. Behandeling van geïnfecteerde macrofagen met Test Drugs / Verbindingen
- TestAmfotericine B, pentamidine en Miltefosine als standaard anti-leishmanial geneesmiddelen voor screening. Bereid voorraadoplossingen van de drugs / testverbindingen in water of DMSO zoals vermeld in tabel reagens. Test elke geneesmiddelverbinding op 6 concentraties.
- Serieel verdund (1:5) de standaard drugs en testverbindingen in een verse 96-well plaat of 2 ml buizen (voor Kamer slides) met RPMI-1640 medium met 2% FBS. De drugs / testverbinding concentraties in deze plaat zijn van 2X eindconcentratie.
- Was de kweekplaten en kamer dia's besmet met L. donovani promastigoten (uit stap 4.5) minstens 5 maal met serumvrij RPMI-1640 medium. Voeg 100 ul kweekmedium (RPMI-1640 met 2% FBS) in elk putje / kamer. De meerdere wasbeurten zijn om een volledige verwijdering van niet-geïnternaliseerde promastigoten waarborgen.
- Voeg 100 ul medium van serieel verdunde standaard anti-leishmanial drugs of de testverbindingen aan elk putje of kamer. Stel de infectieted THP1 cellen bestuurt zonder drugs tegelijk in elke plaat / kamer dia.
- Incubeer de platen en de kamer slides bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
6. Kamer kleuring van preparaten, TL Microscoop beeldvorming en beeldanalyse voor de kwantificering van infectie en Effect van Drug Treatment
- Na 48 uur incubatie was de kamer slede 3 keer met serumvrij RPMI-1640 medium. Trek het plastic kamers van de objectglaasjes en vast de cellen door onderdompelen van de glaasjes in methanol gedurende 30 sec. Laat de dia's in bio-kap onder luchtstroom voor het drogen.
- Bereid een SYBR Green I kleuroplossing (5X) door verdunning (1:2000) de stock (10.000 X) met water.
- Vlekken op de dia onder donkere omstandigheden met de verdunde oplossing SYBR Green I kleuring voor 15 min bij kamertemperatuur, eenmaal wassen met water en laat de slides in de luchtstroom te drogen.
- Plaats een vol glas dekglaasje over de STAIned dia met behulp van fixeermiddel.
- Leg de digitale beelden van THP1 cellen: zonder infectie (blanco), met infectie (controle), geïnfecteerde cellen behandeld met verschillende standaard drugs of testverbindingen in verschillende verdunningen (figuur 3, 5 en 6)) met een Nikon Eclipse 90i vergezeld fluorescentiemicroscoop door NIS element AR 3.2-software.
- Tel de macrofaag kernen (groot) en de parasiet kernen (klein met kinetoplast) met behulp van ImageJ (figuur 7), dat is een voor het publiek beschikbare, op Java gebaseerde beeldverwerking-programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health ( http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). Druk het data het aantal amastigoten per 100 getransformeerde cellen THP1.
7. De Parasite-Rescue-Transformatie-test: Gecontroleerde lysis van L. donovani amastigoten-geïnfecteerde macrofagen
- Was de 96-well microplaat van stap 5.5 driemaal met serum-vrij RPMI-1640 kweekmedium.
- Tussen verschillende reinigingsmiddelen getest bij verschillende concentraties, 0,05% SDS behandeling van 30 sec optimaal voor gecontroleerde lysis (maximum cellysis met minimaal verlies van geredde parasieten levensvatbaarheid).
- Verwijder het serumvrije medium uit elk putje na de laatste wassing en voeg 20 ul RPMI-1640 (met 0,05% SDS) aan elk putje. Schud de plaat gedurende 30 sec en voeg 180 ul compleet RPMI-1640 (met 10% FBS) in elk putje.
- Incubeer de platen bij 26 ° C gedurende 48 uur voor transformatie van geredde amastigoten te promastigoten.
8. Kwantitatieve analyse van getransformeerde Promastigote (AlamarBlue assay)
- Na 48 uur incubatie bij 26 ° C, de geredde levende amastigoten worden omgezet in promastigoten (Figuur 1D). Voeg 10 ul van AlamarBlue in elk putje van de 96-well plates.
- Incubeer de platen bij 26 ° C geroerd.
- Na een nacht incubatie, lees de platen voor standaard fluorescentie op een Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) bij 544 nm excitatie, 590nm emissie.
- Bereid de dosis-respons curves (procent groei versus concentratie van het geneesmiddel of testverbinding) met ExcelFit (figuren 7-9) en bereken IC 50 / IC 90-waarden uit deze curven (tabel 1).
9. Standaardisatie van THP1 cellen te Parasieten Ratio
- Standaardiseren THP1 cellen parasieten verhouding gevoeligheid van de assay te bepalen. Opmerking: Laag / hoog parasieten nummers / infectie kan een compromis met de gevoeligheid en selectiviteit van de screening.
- Standaardiseren van de THP1 cellen om parasieten verhouding door het volgen van het hierboven beschreven protocol voor THP1 cellen zaaien en Leishmania promastigote infectie (hoofdstuk 3 en 4), behalve het gebruik different verhoudingen van THP1 cellen parasieten 1:1,25, 1:2,5, 1:5 en 1:10.
- Stel het experiment zowel in 16-kamer slide (voor beeldanalyse) en 96-well plaat (voor parasiet-rescue assay) formaten om de parasiet reddings-en beeldanalyse testen vergelijken.
10. Standaardisering van verschillende detergentia voor gecontroleerde cellysis
- Het primaire doel van dit experiment is om het protocol te optimaliseren voor gecontroleerde lysis van de cellen THP1 tot maximaal / volledige THP1 cellen lysis te bereiken zonder significante gevolgen voor de levensvatbaarheid van de geredde amastigoot parasieten.
- Testen verschillende detergentia zoals Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 en SDS bij verschillende concentraties en verschillende duur van de behandeling (figuur 2).
- THP1 cellen parasieten verhouding 1:10 en andere voorwaarden zijn vergelijkbaar als hierboven secties 1-8.
- Test de 0,05% SDS behandeling verder voor de verschillende duur van de behandelings verder optimaliseren van de gecontroleerde cellysis.
Representative Results
Een kwantitatieve analyse werd gedaan voor zowel digitale-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor 24, 48, 72 en 96 uur na de behandeling met geneesmiddelen
In de directe telmethode, infectie van L. donovani-geïnfecteerde macrofagen (THP1 cellen) werd berekend met de volgende vergelijking:
De amastigoten (bepaald door het tellen amastigoten kernen) / 100 getransformeerde THP1-cellen (bepaald door het tellen geteld THP1 celkernen) (figuur 7) is een nauwkeurige maatstaf voor het effect van verschillende standaard of testverbindingen analyseren dan het percentage geïnfecteerde cellen THP1 , zoals gerapporteerd in eerdere documenten, omdat dit aantal is direct gerelateerd aan totale effect van verbindingen, hetzij door een afnamein parasieten in macrofaagcellen of volledige verwijdering van de parasiet macrofaag cells.Infection werd berekend uit digitale beelden van geïnfecteerde THP1 cellen behandeld met verschillende standaard drugs bij verschillende verdunningen voor verschillende tijdsintervallen (Figuur 10 en Tabel 1). De uitlezing voor de Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-assay werd amastigoten infection/100 getransformeerd THP1 cellen, terwijl de uitlezing voor de Parasite-Rescue-Transformatie-test werd relatieve fluorescentie-eenheden (RFU), die recht evenredig met het aantal levende Leishmania amastigoten gered uit de geïnfecteerde macrofagen en veranderen in promastigoten. De AlamarBlue test wordt routinematig gebruikt voor Leishmania promastigoten anti-leishmanial drug discovery.
De test werd aanvankelijk gestandaardiseerd en geoptimaliseerd voor gecontroleerde lysis van Leishmania-geïnfecteerde cellen THP1. Het doel was om de voorwaarden te optimaliseren voor reinigingsmiddel treatment, die bijna volledige lysis van cellen THP1 leveren met minimaal effect op de levensvatbaarheid van de geredde amastigoten. Figuur 1 toont een microscopisch beeld van de volledige assay protocol. Intact THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania amastigoten te zien in figuur 1A. 1B toont lysis van de cellen na THP1 detergent behandeling. Figuur 1C toont gered Leishmania amastigoten, die gedeeltelijk omgezet in promastigoten en Figuur 1D toont bijna volledige omzetting van amastigoten in promastigoten en de daaropvolgende proliferatie. De groei van deze getransformeerde promastigoten kwantitatief worden gevolgd met toevoeging van AlamarBlue en meting van fluorescentie op een microplaatlezer. Behandeling met NP-40 (Figuur 2A) en Triton X-100 (Figuur 2B) gelyseerd de geïnfecteerde cellen THP1, maar het ook invloed op de levensvatbaarheid entransformatie van de geredde amastigoten. Behandeling met Tween 20 (figuur 2C) en Tween 80 (figuur 2D) veroorzaakten geen optimale lysis van THP1 cellen resulterend in een onvolledige redding van amastigoten zoals aangegeven door lage aantallen getransformeerde promastigoten. De behandeling met 0,05% SDS gedurende 30 seconden (figuur 2E) leverde bijna volledige lysis van Leishmania-geïnfecteerde THP1 cellen en had geen invloed op de levensvatbaarheid en de transformatie van geredde amastigoten. Verdere optimalisatie bleek dat behandeling van cellen met 0,05% SDS gedurende 20-30 sec leverde hoogste redding van levensvatbare Leishmania amastigoten (figuur 2F). In daaropvolgende experimenten behandeling met 0,05% SDS gedurende 30 sec werd gebruikt. Procedure voor SDS behandeling is dezelfde voor een of meerdere platen. In meerdere platen, werd SDS behandeling geïmplementeerd kolom per kolom met een meerkanaals pipet. Serumvrij medium werd verwijderd van alle 8 putjes van een kolom van de plaat en 20 & mu, L 0,05% SDS toegevoegd in 8 putjes van dezelfde kolom en verdund na 30 sec met RPMI-1640 met 10% FBS. Tijdens de eerste standaardisatie van de assay werden de platen gecontroleerd onder de microscoop niet-geïnternaliseerde promastigoten. Een minimum van vijf wassingen waren nodig voor het verwijderen van parasieten voor stap 5 behandeling van geïnfecteerde macrofaag-cellen met standaard verbindingen en drie wassingen waren nodig voor stap 7 van SDS behandeling. Zo werden de cellen 8 maal gewassen en geen zichtbare niet-geïnternaliseerde promastigoten nog voordat de controle lysis van geïnfecteerde cellen THP1.
Digital Image Analysis en Direct Counting
De digitale beelden van Leishmania-geïnfecteerde THP1-cellen werden op Nikon Eclipse 90i fluorescentie microscoop na kleuring met SYBR Green I. Zowel macrofagen kernen en intracellulaire Leishmania kernen met karakteristieke kinetoplast DNA waargenomen bij tl filters (figuur 3). Verder werden de beelden van geïnfecteerde cellen THP1 ook gevangen onder DIC. Wanneer zowel de beelden werden samengevoegd, werden de contouren van THP1 cellen intracellulaire amastigoten duidelijker zichtbaar (figuur 4). De ImageJ software werd gebruikt om deze beelden te analyseren. ImageJ is een publiek domein, op Java gebaseerde, beeld-processing programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health ( http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ is ontworpen met een open architectuur die uitbreidbaarheid via Java plug-ins en opneembare macro's biedt. Custom acquisitie, analyse en verwerking van plugins kunnen worden ontwikkeld met behulp van ImageJ de ingebouwde editor en een Java-compiler. Voor differentiële telling van THP1 cellen kernen en parasieten kernen door ImageJ, werd het beeld geopend in ImageJ. Celgetalmeter werd gevonden in Analyze optie in plugin van de Software. Het beeld werd geïnitialiseerd en celgetalmeter type 1 werd geselecteerd voor THP1 cell kernen en celteller type 2 werd geselecteerd voor parasiet kernen (figuur 3). Differentiële telling werd gedaan gedurende 200 THP1 celkernen en het intracellulaire amastigoten in deze THP1 celkernen. Een vergelijking van parasiet-rescue assay en beeldanalyse methode werd voor de evaluatie van de infectiviteit van THP1 cellen met verschillende macrofagen:. Promastigoten verhoudingen (figuur 4) Figuur 5 geeft het verschil infectiviteit in THP1-cellen bij verschillende macrophage: promastigote verhoudingen. Beide methoden gaven vergelijkbare resultaten en de macrofaag: promastigote van 1:10 leverde optimale en reproduceerbare infectiviteit.
Nadat de voorwaarden voor parasite-rescue/transformation assay en de digitale beeldanalyse werden geoptimaliseerd, werd de bruikbaarheid van deze assays geëvalueerd anti-leishmanial drug screening. De Leishmania-geïnfecteerde THP1 cellen werden behandeld met verschillende concentraties van een standaardnti-leishmanial drugs namelijk Amfotericine B, Pentamidine en Miltefosine voor verschillende tijdsintervallen van 24 tot 96 uur. Het experiment parasiet gered / transformatie test werd uitgevoerd in drievoud en de directe experiment cellen telmethode werd in tweevoud. Figuur 6 toont microscopische foto's van geïnfecteerde controle, onbehandelde controle en geïnfecteerd Leishmania-infectie behandeld THP1-cellen. De dosis-respons curves werden bereid uit de parasiet-rescue en transformatie assay (concentratie van het geneesmiddel versus getransformeerde parasieten) en beeldanalyse assay (aantal amastigotes/100 THP1 cellen) (figuren 7-9). De IC50 van de geneesmiddelen werden berekend door ExcelFit en zijn weergegeven in tabel 1. Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test toonde vergelijkbare resultaten. Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test was minder optimaal tijdens de vroege tijdstippen van 24 en 48 uur drugs treatments, terwijl de Parasite-Rescue-Transformatie-test toonde resultaten meer in overeenstemming met de gerapporteerde waarden op alle tijdstippen tijdens de 24 tot 96 uur na behandeling met geneesmiddelen. Dit verschil in resultaten met Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test kan door de aanwezigheid van niet-levensvatbare amastigoten zijn tijdens de vroege periodes van behandeling met geneesmiddelen in Digitale-Image-Analysis-Direct-tellen -Assay.
Figuur 1. Een microscopisch beeld van de Leishmania donovani amastigoten reddings-en transformatie naar promastigoten. A - Hechtende THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania amastigoten, B - aanhanger, geïnfecteerde cellen THP1 na gecontroleerde lysis C - Getransformeerde Leishmania donovani promastigoten van de amastigoten geïnfecteerde gered uit THP1 macrofaagcellen D - groei en proliferatie van transformed Leishmania donovani promastigoten.
Figuur 2. Optimalisatie van gecontroleerde lysis van geïnfecteerde cellen THP1 maximum redding van levende Leishmania donovani amastigoten en hun transformatie bereiken promastigoten. Analyse van lysis van cellen en THP1 redding van amastigoten van de Leishmania-geïnfecteerde cellen met THP1 verschillende reinigingsmiddelen. Twee concentraties (0,05% en 0,1%) van detergent en twee perioden (30 sec en 60 sec) voor behandeling werden getest. RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Elke staaf stelt het gemiddelde van dubbele waarnemingen. [A] NP-40 behandeling veroorzaakte lysis van cellen en THP1 ook invloed op de levensvatbaarheid van de geredde amastigoot parasieten. [B] Triton X-100 treatment veroorzaakt lysis van cellen en THP1 ook invloed op de levensvatbaarheid van de geredde amastigoot parasieten [C] Tween 80 veroorzaakt gedeeltelijke lysis van cellen THP1 de amastigoten redden. [D] Tween 80 veroorzaakt gedeeltelijke lysis van cellen THP1 de amastigoten redden. [E ] SDS behandeling veroorzaakt bijna volledige lysis van THP1 cellen en heeft levensvatbaarheid van de geredde amastigoten geen invloed op 0,05% / 30 sec. [F] De behandeling met 0,05% SDS gedurende 20-30 sec veroorzaakt bijna volledige lysis van THP1 cellen en gered levensvatbare parasiet amastigoten om te zetten in promastigoten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Fluorescent digitaal beeld van een gedifferentieerde cel die is geïnfecteerd THP1 in vitro met Leishmanieen donovani amastigoten. De karakteristieke kDNA kan ook worden gezien met elke parasiet kern. De macrofaag nucleus (mN) (1) en de parasiet kernen (pN) (2) kan differentieel worden gemerkt en differentieel geteld ImageJ analyse software voor kwantitatieve evaluatie van de infectie. De kwantificering werd gedaan aantal amastigotes/100 THP1-cellen.
Figuur 4. Vergelijking tussen Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-test (onderste paneel) en Parasite-Rescue-Transformatie-test (bovenste paneel). De macrofaag: promastigote van 1:10 leverde optimale infectie. Beide gaf vergelijkbare resultaten. De parasiet-rescue assay toonde enkele achtergrondwaarden. Elke staaf geeft gemiddelde van dubbele waarden.
Figuur 5 THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania promastigoten door verschillende THP1:. Promastigote ratio. De kwantitatieve resultaten aantal amastigotes/100 THP1 cellen zijn weergegeven in Figuur 4.
Figuur 6. Digitale beelden (TL + DIC) van THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania donovani amastigoten na behandeling met standaard anti-leishmanial geneesmiddelen voor verschillende perioden. De resultaten werden gekwantificeerd als het aantal amastigotes/100 THP1-cellen en gebruikt om het percentage groei berekenen vergeleken met onbehandelde en de IC50 waarden te bepalen.
Figuur 7. Vergelijking van Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor anti-leishmanial drug screening (Amophotericin B). De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC 50 (pg / ml) waarden werden berekend op basis van de dosis-respons curve van Excelfit. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 8. Vergelijking van Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-Assay voor eennti-leishmanial drug screening (Pentamidine). De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC50 (ug / ml) waarden werden berekend uit de dosis respons curven Excelfit. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Figuur 9. Vergelijking van Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor anti-leishmanial drug screening (Mitefosine). De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC50 (ug / ml) waarden werden berekend uit de dosis respons curven Excelfit.Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Test Drug | 24 uur een | 48 hr een | 72 uur een | 96 uur een | ||||
| IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | |
| Amfotericine B | 0,24 ± 0,03 | 0,17 ± 0,01 * | 0,12 ± 0,04 | 0,20 ± 0,07 | 0,06 ± 0,01 | 0,06 ± 0,01 | 0,11 ± 0,03 | 0,10 ± 0,03 |
| Pentamidine | > 10 | 2,55 ± 1,16 * | 2,88 & plusmn; 0,58 | 1,43 ± 0,91 | 1,24 ± 0,35 | 1,52 ± 0,16 | 0,71 ± 0,63 | 0,98 ± 0,33 |
| Miltefosine | 0,38 ± 0,02 | 0,19 ± 0,08 * | 0,24 ± 0,06 | 0,30 ± 0,08 | 0,36 ± 0,02 | 0,16 ± 0,06 | 0,21 ± 0,15 | 0,17 ± 0,10 |
Tabel 1. Vergelijking van de Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor anti-leishmanial drug discovery. De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC50 (ug / ml) waarden werden berekend uit de dosis respons curven Excelfit (figuren 7-9) een uur na behandeling met geneesmiddelen;. IACA b = Image Analysis and Direct CountingAssay, c PRTA = Parasiet-Rescue en Transformatie Assay. Opgegeven waarden zijn IC50 (concentratie van het geneesmiddel die 50% inhibitie in parasiet groei) ug / ml en zijn het gemiddelde ± SD van ten minste drie experimenten. * Statistisch verschillend (<0,05) vergeleken met IC 50-waarden met IACA.
Discussion
Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor anti-leishmanial drug screening gebaseerd op macrofagen amastigoot modellen. Testen kunnen worden uitgevoerd met de macrofagen vanuit gastheerdieren namelijk peritoneale exudaatcellen (PEC), perifeer bloed monocyt-cellen (PBMC) 6 of beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM) of monocytische cellijnen zoals muis (J774 en RAW264.7 ) 7 en menselijke (THP1, U937, HL-60) 8 monocytcellen. De assays, die gebruik maken van delende gastheercellen, moet ervoor zorgen dat de verstorende effecten van drugs activiteit op zowel de parasiet en de gastheer cellen nummer worden beschouwd. De gesplitste primaire macrofagen uit verschillende bronnen zoals muizen en ratten zijn niet-delende karakter, maar deze celbereidingen kunnen niet homogene celpopulaties. Monocytcellen-afgeleide cellijnen homogeen van aard zijn en een beter model voor de macrofaag-amastigoot gebaseerde screening. Uit verschillende monocytische cellijnen, differentiated THP1-cellen (menselijke acute monocytische leukemie cellijn) kunnen een niet-delende monolaag en bieden een aantrekkelijk alternatief voor primaire geïsoleerde macrofagen.
De macrofaag-amastigoot gebaseerde screening kan op verschillende manieren. Klassieke microscopische evaluatie op basis van directe cel-en parasiet tellen 9 is arbeidsintensief. De afwezigheid van automatisering beperkt de bruikbaarheid van deze assay. Telling van cellen is tijdrovend en onnauwkeurig bepaling van IC50 waarden geven omdat bepaling van levensvatbaarheid door een parasiet kleuring procedure is moeilijk. Veel fluorescente kleurstoffen en monoklonale antilichamen kunnen worden gebruikt voor flowcytometrische assays 10, 11, maar deze testen zijn ook beperkt door minder gevoeligheid en beperking van tijdsinterval van geneesmiddel-behandeling slechts een dag. Er zijn verschillende reportergen testen beschikbaar voor het kwantificeren van de intracellulaire groei van amastigoten 12.13.14. Een automaated screening worden geëvalueerd door middel reportergenen, maar deze assays ook bepaalde nadelen. Eerste deel van deze tests moeten drug selectie voor behoud van de episomale expressie van de reporter genen, die niet ideaal voor de drug screening experiment. De manier waarop de reporter gen wordt geïntroduceerd kan beïnvloeden de fysiologische eigenschappen van de parasiet en invloed op de screening. Als het reportergen is het deel van een episomaal plasmide kan het relatieve vermogen van reporter afhankelijk van het aantal kopieën van de getransfecteerde plasmide (die varieert tussen cellen) dan op de activiteit van het geneesmiddel 14. Sommige reporter parasieten die worden getransformeerd parasieten niet selectieve druk om het reportergen moeten handhaven, maar er kan biologische gevolgen hetzij door verstoring van de genomische architectuur of alleen door de aanwezigheid van vreemde reporter eiwitten 15. In sommige reportergen gebaseerde assays zijn erkwesties van gevoeligheid en achtergrond activiteit 16. Het belangrijkste is dat veel van de reporter genexpressie-assays, speciaal degene met GFP reporter gene15, geen onderscheid tussen de levende en dode intracellulaire amastigoten. Bepalingen op basis van luciferase reportergen kan onderscheiden tussen levende en dode intracellulaire amastigoten, maar substraat en cellysis buffer voor deze assays zijn duur voor grootschalige screening 17. Om deze minpunten en beperkingen van eerdere macrofaag-amastigoot-gebaseerde Screeningtesten te overwinnen, hebben we ontwikkeld en geoptimaliseerd deze parasiet-rescue en transformatie test. Deze assay is gebaseerd op THP1-cellen, die goede homogeniteit hebben en niet-delende niveau, zoals gastheercellen.
De Parasite-Rescue-Transformatie-Assay assay hier beschreven is vergelijkbaar met de assay gebaseerd op Digital Image-analyse-Direct-tellen van de intracellulaire amastigoten. Fluorescerende en DIC microscopie, digitale image analyses door ImageJ voor differentiële telling van de macrofaag kernen en de parasiet kernen zijn verder verfijnd de microscopische telling test. Het vastleggen van de beelden onder TL-licht filters en differentieel interferentie contrast (DIC) filters zijn verbeterd de kwaliteit van het digitale beeld voor een nauwkeurigere telling van de intracellulaire parasieten. Zowel TL-en DIC beelden kunnen worden samengevoegd om de digitale beelden te verkrijgen met duidelijke macrofaagcellijnen contouren en fluorescerende intracellulaire kernen. De macrofaag kernen en de parasiet kernen kan verschillend worden erkend met ImageJ. Daarom, zowel digitaal-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test hebben het potentieel voor automatisering en toepassing op grote schaal screening. De kritische stappen in de Parasite-Rescue-Transformatie-Assay zijn: (a) herhaald wassen van THP1 celculturen na blootstelling aan Leishmania promastigoten, bijna volledige verwijdering van de niet-intern waarborgenalized promastigoten en (b) gecontroleerde lysis van de geïnfecteerde cellen met SDS THP1. Zowel de stappen kunnen worden bediend met automatisering en niet compromis met doorvoer van de test. De tweede stap van waswater, na blootstelling van de Leishmania geïnfecteerde cellen THP1 de testgeneesmiddelen / verbindingen neemt het overblijvende niet-geïnternaliseerde parasieten, indien aanwezig. De Parasite-Rescue-Transformatie-assay biedt aanzienlijke voordelen boven bestaande microscopische reportergen en beeldanalyse assays. De assay is eenvoudig, robuust en reproduceerbaar kunnen worden geautomatiseerd voor grootschalige screening en daarom moeten belangrijke toepassing in het screenen van grote bibliotheken verbindingen voor nieuwe anti-leishmanial drug discovery. Verder kan de assay ook worden toegepast voor de evaluatie van klinische infectiviteit, en, laboratorium isolaten van Leishmania in vitro.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De NCNPR-USDA-ARS Wetenschappelijk overeenkomst No 58-6408-2-0009; CDMRP subsidie Award # W81XWH-09-2-0093 door het Amerikaanse leger Medisch onderzoek en Materieel Command.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H.
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
