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Biology

蛋白复合物的鉴定 doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

亲和纯化标签蛋白结合质谱(APMS)是一个功能强大的蛋白质相互作用网络系统的映射方法和调查的生物过程的机理的基础。在这里,我们描述了一个优化的顺序肽亲和力(SPA)APMS程序开发的细菌

Abstract

由于大多数大分子组件,系统识别的蛋白-蛋白相互作用(PPI)和确定的亚基组成的多蛋白复合物,可以帮助了解基因的功能和增进了解的生物系统1,2介导的细胞过程。可以被映射的物理相互作用,与高的信心vialarge规模接近生理条件下,基于与质谱(APMS)亲和纯化的染色体标记的蛋白质组合的内源性蛋白复合物的分离和鉴定的。这种方法已成功地应用在进化上不同的生物,包括酵母,果蝇,蠕虫病毒,哺乳动物细胞和细菌1-6。特别是,我们已经产生了一个羧基末端的顺序肽亲和(SPA)亲和纯化的天然蛋白复合物从培养革兰阴性大肠杆菌双标记系统,使用GEnetically听话的主机实验室菌株全基因组调查的基本生物学和保守的过程中原核生物1,2,7,非常适合。我们的SPA标记系统是类似于酵母8,9最初开发的串联亲和纯化方法,由钙调蛋白结合肽(CBP)的后跟的高度特异性的烟草蚀刻病毒 (TEV)蛋白酶的切割位点和三个副本FLAG表位(3X FLAG),允许两个连续两轮亲和富集。盒扩增后,序列特异性的线性编码的SPA-tag和可选择标记的PCR产物是集成的,表示帧作为羧基末端融合在DY330背景下,瞬时表达被诱导高效率的异源λ噬菌体重组系统10。随后的双步纯化使用调钙蛋白和抗FLAG亲和珠使高度选择性甚至大型文化低丰度蛋白复合物和有效的恢复。串联质谱法,然后使用,以确定稳定地共同净化蛋白具有高灵敏度(低纳克检出限)。

在这里,我们将详细介绍一步一步的程序,我们通常使用的系统蛋白标记,分离纯化和质谱为基础的分析可溶性蛋白复合物E.大肠杆菌 ,可以按比例增加和潜在的针对其他细菌物种,包括某些服从重组工程的机会病原体。由此产生的物理相互作用通常可以发现有趣的组件和连接提出新的机械链接。 PPI数据整合与的备用分子协会提供的数据,如遗传(基因 - 基因)的相互作用和基因组上下文(GC)的预测可以方便的多蛋白复合物的的全球分子组织的澄清在BI目的论的途径。 E.产生的网络大肠杆菌可以使用的功能结构,其他微生物的同源基因产品的功能注释目前缺乏深入了解。

Protocol

1。 SPA标记基因特异性E.建设大肠杆菌 DY330应变

  1. 包围的质粒pJL148 SPA-标签的DNA序列和卡那霉素的抗生素抗性标记盒(阚R)被用作聚合酶链反应(PCR)扩增7中的一个模板。一名45 nt的特定基因的正向引物,位于紧接在帧的目标基因的终止密码子的上游侧与一个27 bp的(5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3')标记特定的正向引物,和一个45 nt的基因特异的反向引物,位于紧接在帧与一个27 bp的(GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT 5'-3'),标记特定的反向引物,靶基因的终止密码子下游的是用于扩增的SPA-标签和Kanŕ盒从pJL148使用以下的PCR循环条件为:94 ℃下5分钟,30个循环的94℃1分钟,55℃下1分钟,68℃下2分10秒,然后通过68℃10分钟。这些扩增的序列服务s衬底为异位引入的λ-红同源重组机制(见下文)。
  2. 将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒进行纯化,以去除盐,可能会干扰电穿孔。纯化的PCR产物随后针对整合DY330菌株,其中的λ-Red重组机械表示10在一个特定的基因的3'末端(紧邻上游侧的本机的终止密码子)。
  3. DY330λ-红表达株在2毫升的Luria-Bertani(LB)培养基中生长过夜,在32℃以180rpm摇动。 1毫升过夜培养随后接种到70毫升的新鲜LB培养基中,在500毫升的锥形烧瓶中。接种物在32℃下生长,通过以180rpm摇动,直到OD 600达到约0.8。
  4. 将培养物转移到新鲜的250毫升锥形烧瓶中,烧瓶中,在水浴中在42℃下轻轻振荡孵育的细胞被诱导180 rpm离心15分钟。诱导后,立即在冰水浆浴保温烧瓶振摇至少30分钟。
  5. 冰冷的文化立即转移到预冷的50ml聚丙烯管中,并进行离心6分钟,在4℃下3,993 xg离心将细胞沉淀重新悬浮在50毫升冰冷的无菌水,并离心,再次在4℃下以3993×g离心6分钟然后将细胞沉淀重新悬浮于1毫升冷水转移到1.5ml Effendorf管,在4℃下持续20秒,并以最大的速度离心两个或三个用冰冷的水洗涤步骤后,将细胞沉淀再悬浮终于在700微升冰冷无菌水,得到的电感受态细胞中。
  6. 通过电穿孔,纯化的扩增子的1微升40微升电感受态细胞中导入。细胞在用Bio-Rad GenePulser II具有以下设置:2.5千伏,25μF用脉冲电穿孔的控制器200Ω。经过同源重组和整合,转化,成功地重组到染色体上的标记/盒的选择是基于抗菅直人( 图1A)。选择多个转化子用于Western印迹以验证正确的代( 阳性信号)的SPA-标签的融合蛋白与抗FLAG M2抗体,该抗体是有选择性的对FLAG表位的SPA-标签。
  7. 证实羧基末端SPA-标签融合菌株培养在一个大型隔离可溶性的蛋白质复合物,从收获的细胞使用的SPA纯化协议。亲和标记纯化过程中所涉及的步骤的概要的图1B中所示。

2。培养和超声

  1. 接种100微升的SPA-标签E.入50毫升优质肉汤(TB)的大肠杆菌甘油液体培养基用50μl的25微克/毫升邻f阚溶液在250毫升的锥形烧瓶中。过夜培养的速度增长,在32°C。
    注:由于温度诱导λ红盒的控制下的一个温度敏感的阻遏物10在应变DY330,SPA-标签的大肠杆菌菌株在32℃下生长
  2. 转移10毫升过夜培养的新鲜TB990毫升补充25微克/毫升的菅直人在4升的烧瓶。将培养生长在32℃下以恒定以250rpm振摇,5至6小时,直到OD 600达到〜2至3。
  3. 转移1升E.大肠杆菌 SPA,的标记文化,清洗离心瓶和旋转的细胞在4°C贝克曼J6-HC离心 ​​机@ 3993 xg离心15分钟。
  4. 弃去上清液,将离心瓶。重悬E.大肠杆菌细胞沉淀用25ml的超声缓冲液。确保在任何时候都保持在冰上的离心瓶。
  5. 再悬浮颗粒转移至50毫升聚丙烯Falcon管中,并用液氮冷冻。冷冻的细胞储存在-80℃下长期使用。
  6. 之前,超声处理,完全解冻的冷冻细胞保持在冰上粒料。解冻的样品被转移到一个无菌的不锈钢杯置于冰上超声处理。探头浸没到样品中,并超声处理3分钟。一个额外的2分钟允许过热冷却样品。
  7. 超声处理的细胞裂解液转移到预冷的无菌离心管中,并在4℃下进行离心分离15分钟两次使用JA-17转子@ 35,267 xg离心(16000转)在Beckman离心机。
    注意:在膜蛋白质的纯化的情况下,超声处理的细胞裂解物只有一次离心分离15分钟,因为我们不知道哪部分的膜蛋白,即,无论是在颗粒或上清液中的馏分。因此,为了避免过多的损失的mem跨膜蛋白,我们旋转在高速离心15分钟,且上清液进行随后进行纯化处理(参见下面的步骤),其中1%的洗涤剂用于溶解膜蛋白的细胞。
  8. 从离心管的上清液小心转入到一个50毫升聚丙烯Falcon管中,并用液氮冷冻。超声处理的冷冻的细胞提取物在-80℃的6个月期间的最大存储以备将来使用。

3。亲和纯化

  1. 在使用之前,100微升抗旗M2珠洗涤的AFC缓冲液(10倍体积的30毫摩尔Tris-HCl,150mM的NaCl,0.1%的洗涤剂,和0.1-0.5毫TCEP [三(2 -羧乙基)膦-盐酸])没有洗涤剂和还原剂的TCEP(三(2 - 羧乙基)膦)。
  2. 冷冻,超声处理的细胞提取物是通过放置在冷水管解冻。解冻的细胞提取物保温用3μl的苯并激酶核酸酶在4℃下30分钟到该混合物中,添加非离子型洗涤剂的Triton X-100(洗涤剂的最终浓度应为0.1%)和200μl的悬浮液的抗旗M2琼脂糖珠。
    注意:对于所有的可溶性蛋白质纯化,0.1%的Triton X-100的用来最大限度地减少非特异性吸附,其中作为一种膜蛋白,不同的温和的非离子型去污剂,如C12E8(Octaethylene乙二醇十二烷基醚),DDM净化( n-十二烷基β-D-麦芽糖苷)和麦芽糖-新戊基乙二醇(MNG)可以在1%洗涤剂浓度使用,以提高增溶。由于不同的洗涤剂有不同的膜蛋白增溶效率,建议使用一个以上的洗涤剂来执行独立的蛋白质纯化物。
  3. 的内容是通过旋转管为3小时,在4℃下使用LabQuake摇床轻轻混合。旋转3小时后,离心管在1,700×g离心6分钟。将上清液则removed小心,尽可能地不打扰宽松的珠丸。
  4. 将沉淀重新悬浮于剩余的上清液,然后转移到0.8×4厘米Bio-Rad公司的聚丙烯制备柱。确保删除之列的底部插座插头,使洗脱液的重力流排水。洗柱5次与TEV裂解步骤。
  5. 排出洗涤后的洗脱液后,在塔的底部出口被封闭。给相同的列,卵裂进行通过添加约5至10微升(50单位)在色谱柱上的TEV蛋白酶,1X的AFC缓冲液和400微升。确保关闭柱顶部的上限。列包含珠粒过夜,4℃过夜旋转轻轻使用LabQuake摇床。
  6. 取下瓶盖的顶部和在塔底部的插座插头,和漏极TEV酶切后回收的洗脱液含有200μl的悬浮液中钙调蛋白 - 琼脂糖珠,洗涤10到一个新的列大量的钙调素结合缓冲。
  7. 柱的顶部和底部的坚固地拧紧,并且在该列中的内容被通过旋转3小时,在4℃下使用LabQuake摇床轻轻混合。
  8. 经过3小时的旋转,洗脱液被排出,通过删除的列的顶盖和底塞。该柱1X钙调蛋白由一个严格的洗涤用400μl的洗涤缓冲液中钙调素的结合缓冲液中,然后用200μl的洗涤四次。
  9. 在四个级分50μl的一个新的Eppendorf管中,用1X钙调蛋白的洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。分布在两个干净的Eppendorf管中,以等体积的洗脱馏分。这两个管,其后使用高速真空干燥。
  10. 干燥后的洗脱液从一个管是用于运行的银染色凝胶,而其他被存储在-80℃下,使用质谱法之前。

4。银染

  1. 对于银staini纳克,3X SDS(十二烷基硫酸钠)样品缓冲液中的体积的一半加入到50微升的干燥的洗脱液。沸腾的混合物5分钟后,将样品加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
  2. 后凝胶运行完毕后,它被小心地放入定影溶液(50%甲醇和10%乙酸)和20分钟的旋转振荡器上轻轻搅拌。该凝胶在20%乙醇中10分钟,然后漂洗。
  3. 固定凝胶10分钟用500ml双蒸水彻底洗涤两次,以确保均匀的背景低。
  4. 然后轻轻搅拌该凝胶在500毫升钠硫代硫酸钠1分钟,然后由两个用蒸馏水洗涤步骤,持续20秒。
  5. 水被丢弃,并且该凝胶中温育30分钟,0.1%硝酸银的200毫升。经过该时间后,硝酸银被除去,持续20秒,凝胶,用蒸馏水洗涤,以除去过量的硝酸银。
  6. 终于在75毫升的手激动凝胶显影溶液。当达到所需的强度,显影溶液被丢弃,并加入80毫升乙酸,使反应停止。确保孵育凝胶在乙酸,为最少20分钟为适当的可视化的凝胶带。

5。蛋白质和样品制备的质谱分析

  1. 向干燥的样品中,加入50微升的消化缓冲液,0.9微升的100mM的TCEP-HCl(三(2 -羧乙基)膦-盐酸),并在室温下孵育45分钟的混合物 用于还原步骤。接着,加入1微升的500mM碘乙酰胺温育另外40分钟,使样品烷基化在黑暗。
  2. 孵化的第二轮后,添加固定化胰蛋白酶的1微克到混合物中,并在37℃下孵育5小时或在室温下过夜。确保使反应停止,加入1微升的乙酸。
  3. 预湿的Millipo,重新Zip的提示通过吸液的润湿性和平衡溶液的10μl的移液管尖。分配浪费的解决方案。接着吸取10微升的洗涤溶液并和分配溶液的浪费。重复此步骤两次。
  4. 对于给小费的肽混合物的有效结合,吸液混合肽混合物的20倍。附着到前端的肽混合物通过抽吸和分送洗涤溶液洗掉。重复此步骤两次有效结合的肽混合物的小费。
  5. 含有结合的肽的前端,吸液的润湿性和平衡溶液10微升,和分配到一个干净的eppendorf管中。重复此步骤两次。洗脱的样品在高速真空干燥后,可以立即进行分析的样品,通过质谱法或贮存于-80℃,在使用前。

6。 LTQ Orbitrap Velos的质谱仪蛋白质鉴定

钍Ë孤立的复合物的多肽组分确定使用的LTQ Orbitrap Velos的混合串联质谱仪。的Orbitrap具有优异的分辨能力(> 60,000全宽半高,或FWHM)和质量准确度(<2 ppm),最大限度地减少MS / MS抽样的无关的非特异性背景控制净化污染物检测,同时高速Velos离子阱组件可以检测和使用两个电子转移解离和碰撞诱导解离模式的片段的低丰度肽。高置信度的匹配导致MS / MS谱之间的映射到参考E.大肠杆菌的蛋白质序列数据库搜索算法,如SEQUEST和STATQUEST 11的概率算法,像评估过程中的每一个匹配的序列。总的谱号,肽序列的唯一性和阴性对照( 模拟)净化污染物检测到共同的背景被认为是实现一个低的实证假显示covery率。下面的步骤进行蛋白质鉴定:

  1. 微色谱柱填充有〜10厘米为3μm的Luna-C 18的树脂中,并且连接到一个Proxeon纳升电离子源被放置在符合文书的Orbitrap。
  2. 一个Proxeon纳米流的二进制的HPLC泵是用于提供一个稳定的尖流量约300 NL分钟-1在多肽分离。
  3. 为了达到肽洗脱,根据样品的复杂性有机缓冲液梯度设置。例如,下面的梯度通常设置的大肠杆菌大肠杆菌 SPA样品:在1分钟内,从2%至6%的溶剂B增加,在38分钟至24%,至100%,在接下来的4分钟,保持在100%,持续1分钟,然后在1分钟内减少到2%,最后15分钟保持在2%。流动相:溶剂A具有HPLC梯度95%水和5%乙​​腈,0.1%甲酸,而溶剂B有HPLC梯度5%的水和95%乙腈,含0.1%甲酸阿哲四。针尖处的流速设定为60分钟至300 NL分钟-1。
  4. 运行在60000决议通过一个完整的质量扫描随着质谱仪周期的,随之而来的串联碎片的质量扫描所收集的最激烈的前体离子。动态排除,单一同位素质量的选择,依赖于数据的实时采集仪的功能被启用。
  5. 光谱使用一个数据库搜索算法对数据库的大肠杆菌如SEQUEST搜索大肠杆菌的蛋白质序列,并将结果进行统计过滤使用一个的概率算法如STAQUEST 11,以确保低假发现率。只有高置信度(99%概率)考生选择,而比赛显示超过10 ppm的质量误差的理论肽质量进一步考虑被淘汰。

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Discussion

这里所描述的一个关键方面SPA基于APMS方法的的标记内的天然染色体背景下进行,从而确保维持正常的基因调节( 原生饵子保存的,因此,表达水平不扰动)和本机稳定相关蛋白质复合物中回收在近内源性水平。正负极性问题,也避免包括选择标记朝外启动。这SPA-标记的方法是有效的,足以净化组件的低丰度的配合物不久的均匀性,包括膜相关的组件,即使亚基表达下降到只有几个分子每个细菌细胞。总体而言,该协议可以很容易地扩展为净化标记的可溶性蛋白在大肠杆菌中的大套大肠杆菌或原则上任何其他细菌物种的标记通过重组工程是可能的,或者是那些具有自然高转换的TION能力,如不动杆菌,细菌遗传学的一个新兴的主力,已被使用,例如,,到建立一个应变库,有针对性的基因敲除13。

固有的大规模蛋白质组学方法的一个主要关注是混杂的非特异性团团员和虚假的痕量污染的鉴定。尽管两轮丰富,我们的日常SPA净化定期检测常见的污染物,通常是高丰度的看家蛋白,如核糖体蛋白和伴侣,非特异性结合的色谱树脂和/或诱饵蛋白。在两种方式中,这个问题可以得到缓解。首先,确定每个蛋白质与某一特定的诱饵的的频谱数量和独特性,被认为是一个更广泛的多个不相关的蛋白质纯化的诱饵和标记( 野生型)阴性对照株( 模拟亲和纯化experiments),以尽量减少假阳性协会。二,所有的候选蛋白质相互作用,相互标记和纯化的公认的具有约束力的合作伙伴,与独立证实个人的蛋白质 - 蛋白质相互作用的目标,以避免极少数情况下存在的SPA标签扰动将天然蛋白质进行验证内源性蛋白组件。

基于APMS-蛋白质组的调查只限于在确定瞬态或亚化学计量的相互作用缺乏敏感性。在这种情况下,可以使用单步纯化程序,以提高检测较弱的相互作用伙伴。在过程中,我们持续的,长达十年的研究的E.大肠杆菌相互作用组,我们看到了新一代质谱仪的检测能力稳步提高。较旧的仪器是有失偏颇经常性的高丰度蛋白的鉴定,往往无法检测少阿布ndant,但可能是非常重要的相互作用的蛋白质。相反,Orbitrap Velos的杂交质谱仪,我们目前使用的有显着提高了分辨率,质量精度和灵敏度,从而使低丰度蛋白质的更有效率,高通量检测,包括短暂的相互作用。最后,如​​果相互作用的性质是完全陌生的,我们建议研究人员:(一)适用于苛刻的标准来分配所有公认的数据库搜索匹配信心分数。与两个或两个以上的肽的蛋白质通常被认为是积极的,假设每场比赛通过的可能性最低门槛截止的99%或更高的概率;(二)确保检查的特异性的候选蛋白相互作用者记录标签的诱饵(ⅲ)比较,所得结果与阴性对照组未标记的的株(模拟实验)或无关的蛋白毒饵;往复确认含有未知蛋白间的潜在的相互作用美国东部时间通过创建相应的SPA标签诱饵融合的大型净化或验证成对交互使用传统的免疫共沉淀蛋白特异性或标记的特异性抗体。

至目前为止,使用这种系统的方法,我们已经成功地标记和纯化大约三分之二〜2750 E.大肠杆菌可溶性蛋白,可检测的表达在丰富培养基1,2下培养。我们也适于此相同的基本方法,以系统地隔离膜相关的蛋白质复合物,并且正在试图纯化每一个其它的〜1,000 E.大肠杆菌的蛋白质预测是膜结合。虽然膜蛋白的纯化往往带来了独特的挑战,因为它们往往不能有效地溶解的提取缓冲液中,我们通常使用的SPA方法,此外,非离子型去污剂的缓冲区,使大部分的溶解和纯化E.大肠杆菌</ em>的膜蛋白,我们试图日期(Babu 等人 ,未发表数据)。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是从加拿大安大略基因组研究所,加拿大基因组,创新,创新的安大略省,加拿大卫生研究院研究补助金JG和AE红表示E.基金会的资金支持coli菌株DY330从Donald L.法院(美国国家癌症研究所,冯检基,MD)是一种礼物。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
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蛋白复合物的鉴定<em&gt;大肠杆菌</em使用顺序肽亲和纯化技术相结合串联质谱法
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Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

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